[发明专利]用于检测人类CYP2C19基因多态性的引物、探针、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及用于检测人类CYP2C19基因多态性的引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，是人体重要的药物代谢酶，临床上大约2％的药物都由其代谢。目前美国FDA公布将CYP2C19作为药物基因组生物标志物的药物共有十九种，包括氯吡格雷、S-美芬妥英、奥美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等。CYP2C19的基因多态性可导致酶活性的个体差异，使人群出现快代谢型(extensive metabolizer，EM)、中间代谢型(intermediate metabolizer，IM)和慢代谢型(poor metabolizer，PM)。CYP2C19基因的多态性位点很多，东方人携带的等位基因型为CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17，其中CYP2C19*17不会引起代谢活动的降低，CYP2C19*2和CYP2C19*3可引起CYP2C19基因编码的酶活性丧失，从而导致药物代谢能力减弱，引发不良反应。

氯吡格雷(波立维)是目前最广泛使用的噻吩吡啶类抗血小板药，氯吡格雷的临床治疗反应存在着显著的个体差异，部分患者存在氯吡格雷抵抗，影响治疗效果。在CYP2C亚家族中，CYP2C19亚型对药物反应起着关键性的作用。2010年，美国FDA发布警告，要求在氯吡格雷包装上附加“黑格标签”方可出售，建议通过检测CYP2C19的基因型从而指导氯吡格雷的使用剂量。

目前临床应用的基因多态性检测方法主要有四种：直接测序法，PCR-基因芯片法，PCR-溶解曲线法和荧光定量PCR法。测序法虽然为基因多态性检测的“金标准”，但是由于其需要的检测时间长，操作复杂，并且灵敏度不高；PCR-基因芯片法的操作要求高，杂交和洗片都必须避光操作，并且芯片价格昂贵；PCR-溶解曲线法无特异性，并不能精确定位基因变化位置，并且只是因单个碱基差异造成的Tm差异不是很明显，通常会造成在溶解曲线上的峰不是很清晰，因而这三种方法在临床上的推广都存在一定困难。传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测，对于检测人类CYP2C19基因多态性还无法满足高效、精准、简便等要求，同时还需要对样品进行基因组DNA提取等繁琐复杂的操作流程，所以亟需一种快速、有效、精准且无需DNA提取的检测方法。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的科研动态和临床应用，重新设计了用于检测人类CYP2C19基因多态性的引物、探针以及方法。本发明的检测方法简便快速、精准有效、结果简单易辨别且对于小样本依然适用，甚至直接利用血液样品或滤纸干血片样品为模板进行检测也能得到很好的结果。

为此，本发明一方面提供了一种用于检测人类CYP2C19基因多态性的引物和探针组合，其中引物序列如序列1-4所示，探针序列如序列5-8所示，引物序列1-2以及探针序列5-6用于检测CYP2C19*2基因的多态性，引物序列3-4以及探针序列7-8用于检测CYP2C19*3基因的多态性。

在本发明优选的实施方案中，该引物和探针组合中，探针的5’端有FAM或VIC修饰，3’端有NFQ-MGB修饰。

在本发明进一步优选的实施方案中，该引物和探针组合中，每条引物的浓度为300nM，每条探针的浓度为200nM。

本发明基于最新的科研动态和临床应用，重新设计了用于检测人类CYP2C19基因多态性的引物和探针。所设计的引物Tm值均在60℃附近，整合搭配各个引物，从而尽量避免了引物二聚体的产生。同时选用MGB探针使得Tm值均在70℃附近，避免了探针与其他非特异性序列之间的结合，同时也避免了探针相互之间形成复杂的二聚体，提高了荧光PCR扩增的特异性和效率。

针对人类CYP2C19基因多态性的检测，本发明设计的具体引物和探针情况如表1和表2所示。

表1、CYP2C19*2基因检测的引物和探针情况表

表2、CYP2C19*3基因检测的引物和探针情况表

本发明另一方面提供了一种用于检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒，其包含本发明所述的引物和探针组合。

在本发明优选的实施方案中，本发明的试剂盒中还包含阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液为分别含有三种不同CYP2C19*2等位基因和两种不同CYP2C19*3等位基因的五种细胞系DNA，所述空白对照液为TE缓冲液。