[发明专利]藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种藏系绵羊卵巢全蛋白的提取方法。

背景技术

哺乳动物，如藏系绵羊的产羔（仔）数是受排卵数控制的，卵泡发育和排卵的主要场所是卵巢。卵巢是雌性动物位于子宫两侧的一对卵圆形的生殖器官，其主要功能是产生卵子以及类固醇激素。卵巢外部为上皮组织和薄层的结缔组织，内部可分为皮质和髓质，皮质位于周围部分，主要由卵泡和结缔组织构成，髓质位于中部，由疏松结缔组织构成，其中有许多血管、淋巴管和神经，组成结构复杂。

蛋白质样品的制备是双向凝胶电泳技术中一个复杂且关键的过程，蛋白质样品来源千差万别，样品形态不一，因而从蛋白质样品的匀质化，到干扰杂质的去除，再到所需蛋白质的收集，至今还没有标准化的研究方法。不同的物种和组织间蛋白质组成及含量差异很大，适用于不同物种和组织蛋白质提取的方法不尽相同。藏系绵羊卵巢结构复杂，富含脂类及其他干扰物质，对于卵巢蛋白质提取方法的研究主要集中在人及模式动物，但到目前为止，尚未建立一种标准化的藏系绵羊卵巢全蛋白的提取方法。

发明内容

本发明的目的是提供有效的、标准化的藏系绵羊卵巢全蛋白的提取方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法，其特征在于：

取刚宰杀的成年健康经产藏母羊的卵巢，并用PBS缓冲液冲洗干净表面血液和杂质，放入冻存管中，并置于-80℃低温下保存备用；

采用直接裂解法提取卵巢全蛋白，按以下步骤进行，

1）、将卵巢组织用液氮预冷的砸碎器砸碎，将砸碎的粉末用研钵在液氮环境中研磨成粉末；

2）、样品粉末按照1:10（w/v）加入裂解液，涡旋振荡2min；

裂解液I配方：7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS（w/v），0.5% 两性电解质pH 3-10（v/v），65 mmol/L DTT（w/v），10μL/mL PMSF；

在裂解液I配方基础上，结合人及模式动物卵巢全蛋白提取方法，根据绵羊卵巢组成成分及含量特点，对裂解液配方进行改进，配制裂解液II配方和裂解液III配方，对直接裂解法配方进行优化研究；

裂解液II配方：8M尿素，2M硫脲，2% CHAPS（w/v），2% Triton X-100（v/v），0.5% 两性电解质 pH 3-10（v/v），65 mmol/L DTT（w/v），10μL/mL 蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）；

裂解液III配方：8M尿素，2M硫脲，4% CHAPS（w/v），0.25% 两性电解质 pH 3-10（v/v），100 mmol/L DTT（w/v），70 mmol/L Tris，10μL/mL 蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）；

3）、4℃静置30min；

4）、样品放在装有冰水混合物的烧杯里超声，22%振幅；样品置于4℃下裂解2h；

5）、样品在4℃，14000r/min离心1h，取上清；

6）、采用2-D clean（Bio-Rad）试剂盒进行样品处理；

7）、Bradford蛋白定量测量出蛋白浓度后，按照用途不同，分装与保存在-80℃冰箱中备用；

所述PBS缓冲液的pH为7.4。

在步骤4）中，超声顺序：累计超声60s，超0.1s，停1s。

在裂解液配方中，选用CHAPS作为表面活性剂，蛋白酶抑制剂选用蛋白酶抑制剂混合物，DTT作为还原剂，具有抗氧化作用，可以保护酶分子上的还原性基团，维持还原性环境，稳定酶的活性。此法中将DTT的浓度由65 mmol/L增至100 mmol/L，这样可以补偿IEF过程中碱性端DTT的损耗，提高对碱性蛋白的溶解。Tris有很高的缓冲能力，增加70 mmol/L Tris，可以为二硫键的还原提供适宜的环境，抑制某些蛋白酶的活性和增加某些蛋白质的溶解度。此配方获得的凝胶图谱相比于直接裂解法Ⅱ分辨率得到提高，说明增加DTT浓度有助于碱性蛋白的溶解。此配方获得的绵羊卵巢全蛋白质含量、斑点数高于其他方法，凝胶图谱的匹配率和分辨率较高，矩形区域和椭圆形区域内蛋白质斑点数均较多，符合绵羊卵巢蛋白质提取的要求。

作为另一种藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法，其特征在于：

取刚宰杀的成年健康经产藏母羊的卵巢，并用PBS缓冲液冲洗干净表面血液和杂质，放入冻存管中，并置于-80℃低温下保存备用；

采用TCA/丙醇沉淀法提取卵巢全蛋白，按以下步骤进行，