[发明专利]藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法

权利要求书

1.一种藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法，其特征在于：

取刚宰杀的成年健康经产藏母羊的卵巢，并用PBS缓冲液冲洗干净表面血液和杂质，放入冻存管中，并置于-80℃低温下保存备用；

采用直接裂解法提取卵巢全蛋白，按以下步骤进行，

1）、将卵巢组织用液氮预冷的砸碎器砸碎，将砸碎的粉末用研钵在液氮环境中研磨成粉末；

2）、样品粉末按照1:10（w/v）加入裂解液，涡旋振荡2min；

裂解液I配方：7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS（w/v），0.5% 两性电解质pH 3-10（v/v），65 mmol/L DTT（w/v），10μL/mL PMSF；

在裂解液I配方基础上，结合人及模式动物卵巢全蛋白提取方法，根据绵羊卵巢组成成分及含量特点，对裂解液配方进行改进，配制裂解液II配方和裂解液III配方，对直接裂解法配方进行优化研究；

裂解液II配方：8M尿素，2M硫脲，2% CHAPS（w/v），2% Triton X-100（v/v），0.5% 两性电解质 pH 3-10（v/v），65 mmol/L DTT（w/v），10μL/mL 蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）；

裂解液III配方：8M尿素，2M硫脲，4% CHAPS（w/v），0.25% 两性电解质 pH 3-10（v/v），100 mmol/L DTT（w/v），70 mmol/L Tris，10μL/mL 蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）；

3）、4℃静置30min；

4）、样品放在装有冰水混合物的烧杯里超声，22%振幅；样品置于4℃下裂解2h；

5）、样品在4℃，14000r/min离心1h，取上清；

6）、采用2-D clean（Bio-Rad）试剂盒进行样品处理；

7）、Bradford蛋白定量测量出蛋白浓度后，按照用途不同，分装与保存在-80℃冰箱中备用。

2.根据权利要求1所述的藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法，其特征在于：所述PBS缓冲液的pH为7.4。

3.根据权利要求1所述的藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法，其特征在于：在步骤4）中，超声顺序哦：累计超声60s，超0.1s，停1s。

4.一种藏系绵羊卵巢全蛋白提取方法，其特征在于：

取刚宰杀的成年健康经产藏母羊的卵巢，并用PBS缓冲液冲洗干净表面血液和杂质，放入冻存管中，并置于-80℃低温下保存备用；

采用TCA/丙醇沉淀法提取卵巢全蛋白，按以下步骤进行，

1）、将卵巢组织用液氮预冷的砸碎器砸碎，将砸碎的粉末用研钵在液氮环境中研磨成粉末；

2）、取0.1g绵羊卵巢组织样品加入1.5mL 10%TCA/丙酮（w/v, 含蛋白酶抑制剂混合物10μL/mL），涡旋振荡1min后在冰上用22%振幅细胞超声破碎仪震荡，超声顺序：累计60s，超0.1s，停1s，4℃过夜；

3）、将样品在4℃，14000r/min离心30min，弃上清留沉淀；

4）、沉淀加入1mL预冷的丙酮，该丙醇含蛋白酶抑制剂混合物10μL/mL，吹打洗涤后4℃静置20min，并在4℃，14000r/min离心20min，弃上清留沉淀；

5）、 重复步骤4）；

6）、沉淀加入1mL 90%预冷的丙酮（v/v，超纯水配制，含蛋白酶抑制剂混合物10μL/mL），吹打洗涤后4℃静置20min，并在4℃，14000r/min离心20min，弃上清留沉淀；

7）、重复步骤6）；

8）、将沉淀置于冷冻抽干机中冻干；

9）、将冻干后的样品粉末按照1:10（w/v）加入不含溴酚蓝的水化上样液，涡旋振荡2min后置于4℃下裂解2h，每静置30min，涡旋振荡2min；

10）、裂解完毕后，样品在4℃，14000r/min离心30min，取上清；

11）、Bradford蛋白定量测量出蛋白浓度后，按照用途不同，分装并保存在-80℃冰箱中备用。