[发明专利]利用等位基因特异性抑制序列变体的核酸扩增

说明书

本申请是国际申请日为2010年1月7日的国际申请PCT/EP2010/000030进入中国、申请号为201080004356.2的题为“利用等位基因特异性抑制序列变体的核酸扩增”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及基于核酸的分子诊断领域，更具体地说，本发明涉及利用等位基因特异性抑制不需要序列变体扩增的核酸序列扩增的改进方法。

背景技术

基于核酸的诊断测试广泛地用于医学、法医学和环境应用中。检测特定核酸序列中的变异提供关于多态性和突变(包括致病突变)的信息。例如，检测个体的突变基因型为遗传咨询提供携带者的状态。一个更具挑战性的任务是检测源于组织并引起疾病或疾病发展的体细胞突变。例如，许多癌症由特定突变引起。随后，在肿瘤进展期间，其它的突变积累存在于癌细胞中。参见Lea等(2007)Genetic pathways and mutation profiles of human cancers：site and exposure-specific patterns，Carcinogenesis，28(9)：1851-1858；Downward，J.(2003)Targeting RAS signaling pathways in cancer therapy(2005)，Nature Rev.Cancer，3：11-22。这些突变预示疾病结果和对治疗的响应。参见Ikediobi等(2008)Somatic pharmacogenomics in cancer，Pharmacogenomics J.，8：305-314；Pao等(2005)KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib and or erlotinib，PLoS Medicine，2(1)，e17。检测这种突变的能力对癌症诊断和治疗极其有用。然而，突变的检测，尤其是早期检测面临很多技术难题。

检测癌症相关突变的主要难题是其罕见的性质，特别是癌发生中突变刚出现于单细胞时。最初，只有部分细胞携带突变，而周围细胞仍然携带野生型序列。因此在核酸的分离物中，新突变的核酸隐藏于过量的野生型核酸中。许多等位基因特异性检测方法(例如等位基因特异性PCR)包括相对于不需要的序列(野生型序列)，优先扩增目标序列(突变序列)。不幸的是，多数情况下该方法的选择性并不完美，即不需要序列也被扩增，虽然比所需要序列的扩增效率低很多。因为存在的不需要(野生型)序列的摩尔数大大超过突变序列，其扩增劣势被消除，并且野生型序列被显著扩增从而遮蔽了存在的突变序列。

已经开发了应对该难题的一些方法。例如，美国专利号5,849,497和2008年8月5日申请的申请顺序号12/186,311教导了利用防止竞争性不需要序列的扩增的扩增阻断剂。在该方法中，阻断剂是在一个扩增引物的下游与不需要序列(但是不与所需序列)形成稳定杂交体的不可延伸的寡核苷酸。当阻断剂稳定杂交后，缺乏5’-3’核酸酶活性的DNA聚合酶不能完成引物的延伸。该方法的成功依赖于需要序列和不需要序列间的序列差异。该方法最好用于序列之间有多个差异的情形下，以确保阻断剂和待抑制序列之间的杂交稳定，而阻断剂和待扩增序列之间的杂交不稳定。

上述方法有几个技术局限。较长的阻断剂寡核苷酸对阻断更有效，但可能不能区分差异，因此阻断了所有序列变体的扩增。较短的阻断剂可能不能有效阻断任何扩增。在某些序列组成中，可能差异很少以至于阻断剂只能进行非常微弱的区分。因此，在某些有临床意义的基因座中，仅阻断剂还不足以解决等位基因特异性扩增的技术问题。

发明内容