[发明专利]利用等位基因特异性抑制序列变体的核酸扩增

权利要求书

1.一种选择性扩增目标序列的需要变体的方法，所述目标序列以多种变体形式存在，所述方法包括以下步骤：

a)在反应混合物中提供可能包含所述目标序列的至少一种变体的样品；

b)提供能与所述目标序列的多种变体杂交的第一寡核苷酸；

c)提供能与所述目标序列的多种变体杂交的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸的至少部分在3’末端或其附近的一个或多个核苷酸中包含修饰的碱基，且其中所述修饰的碱基是于环外氨基基团的修饰；

d)提供第三寡核苷酸，其与所述目标序列的需要变体杂交的亲和力低于与所述目标序列的不需要变体杂交的亲和力，并设计为与所述第二寡核苷酸杂交相同的链且位于所述第二寡核苷酸下游0-60个核苷酸之间；

e)提供基本上没有5’-3’核酸酶活性的核酸聚合酶；

f)使所述反应混合物进行聚合酶链式反应，

其中所述第一和第二寡核苷酸的量是不相等的，从而使得第一寡核苷酸过量存在；并且当所述第三寡核苷酸杂交于所述目标序列的不需要变体时，所述第三寡核苷酸显著抑制所述核酸聚合酶对所述第二寡核苷酸的延伸，但是当所述第三寡核苷酸杂交于所述目标序列的需要变体时，其基本上不抑制所述核酸聚合酶对所述第二寡核苷酸的延伸。

2.权利要求1的方法，其中所述第一、第二和第三寡核苷酸中的至少一种是标记的。

3.权利要求1的方法，其还包括检测扩增的核酸序列。

4.权利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸是SEQ ID NO:2，所述第二寡核苷酸是SEQ ID NO:3和/或所述第三寡核苷酸是SEQ ID NO:5。

5.权利要求1的方法，其中所述核酸聚合酶具有热启动能力。

6.一种用于选择性扩增目标序列的需要变体的反应混合物，所述目标序列以多种变体形式存在，所述混合物包括：

a)能与所述目标序列的多种变体杂交的第一寡核苷酸；

b)能与所述目标序列的多种变体杂交的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸的至少部分在3’末端或其附近的一个或多个核苷酸中包含修饰的碱基，且其中所述修饰的碱基是于环外氨基基团的修饰；

c)第三寡核苷酸，其与所述目标序列的需要变体杂交的亲和力低于与所述目标序列的不需要变体杂交的亲和力，并设计为与所述第二寡核苷酸杂交相同的链且位于所述第二寡核苷酸下游0-60个核苷酸之间；

d)基本上没有5’-3’核酸酶活性的核酸聚合酶；

其中所述第一和第二寡核苷酸的量是不相等的，从而使得第一寡核苷酸过量存在；并且所述第三寡核苷酸能可检测性地抑制所述目标序列的不需要变体的扩增，但是不抑制所述目标序列的需要变体的扩增。

7.权利要求6的反应混合物，其中所述第一、第二和第三寡核苷酸中的至少一种是标记的。

8.权利要求6的反应混合物，其还包括一定量的所述目标核酸。

9.权利要求6的反应混合物，其中所述第一寡核苷酸是SEQ ID NO:2，所述第二寡核苷酸是SEQ ID NO:3和/或所述第三寡核苷酸是SEQ ID NO:5。

10.权利要求6的反应混合物，其中所述核酸聚合酶具有热启动能力。

11.一种用于选择性扩增目标序列的需要变体的试剂盒，所述目标序列以多种变体形式存在，所述试剂盒包括：

a)能与所述目标序列的多种变体杂交的第一寡核苷酸；

b)能与所述目标序列的多种变体杂交的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸的至少部分在3’末端或其附近的一个或多个核苷酸中包含修饰的碱基，且其中所述修饰的碱基是于环外氨基基团的修饰；

c)第三寡核苷酸，其与所述目标序列的需要变体杂交的亲和力低于与所述目标序列的不需要变体杂交的亲和力，并设计为与所述第二寡核苷酸杂交相同的链且位于所述第二寡核苷酸下游0-60个核苷酸之间；

d)基本上没有5’-3’核酸酶活性的核酸聚合酶；

e)用于扩增核酸所必需的试剂和溶液；

其中所述第一和第二寡核苷酸的量是不相等的，从而使得第一寡核苷酸过量存在；并且所述第三寡核苷酸能可检测性地抑制所述目标序列的不需要变体的扩增，但是不抑制所述目标序列的需要变体的扩增。

12.权利要求11的试剂盒，其还包括一种或多种适用于使核酸焦磷酸解作用最小化的试剂和适用于保护扩增反应免受核酸遗留污染的试剂。