[发明专利]含有gat-tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测的引物和探针及方法

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及基因的定量分析方法，具体是指含有gat‑tpin Ⅱ结构转基因植物实时PCR精准检测方法。本发明采用设计的特异性上游引物序列、下游引物序列、荧光探针序列、DNA稀释液以及Taqman Master mix(2×)和水配制成PCR反应体系，进行定量PCR检测。本发明主要建立了一种高扩增效率、高准确度的Taqman定量PCR检测技术，适用于国内农业转基因生物及产品监督检验、进出境口岸转基因生物及产品检验、企业内部进口原材料含gat‑tpin Ⅱ结构的生物成分检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因的定量的分析方法。

背景技术

随着转基因技术的发展，全球转基因植物种植面积已累积超过20亿公顷。但其在许多国家和地区还未进入商业化发展，仍处于限制性的发展阶段。国际上很多国家对转基因产品实施限量标识和进口，而我国尚无具体的转基因产品标识阈值。转基因植物的种类和数量越来越多的同时，对发展转基因成分含量检测及风险评估技术的要求不断增加和提升，筛选性方法的重要性亦越来越凸显。比如针对转基因常用的35S启动子、NOS终止子等通用元件特异性以及Bt，bar/pat等外源基因特异性的检测技术在高通量的检测工作中已发挥了重要作用。但是这些单个元件特异性的检测方法的重要弊端就是无法避免因天然污染物存在时引发假阳性结果的发生。结构特异性PCR检测技术是基于结合元件与元件之间结构的筛选性方法，兼具筛选和对某元件特异性的优点，它可以有效解决这样的问题。不仅如此，因为相同构建结构的转基因事件通常都是由同一家公司生产的，对某结构的检测可直接溯源到它所属的生产机构。或许这已为人们所共识，现在关于结构特异性PCR检测技术在转基因成分检测中的应用报道也逐渐增多。

98140玉米、356043大豆、73496油菜都是由美国先锋公司生产的含有相同(似)构建结构的抗除草剂转基因转化事件。迄今为止，仅Dreo etal(2012)报道过对所有含有gat-tpriⅡ结构的转基因植物的检测方法，但他使用的Green染料进行实时PCR检测。众所周知，染料法没有涉及特异性探针，任何双链核酸片段的存在都会因非特异的燃料嵌入而产生荧光信号，因此，PCR反应过程中非特异性扩增或者引物二聚体的产生都可能被当做阳性信号，出现假阳性情况，准确性低。

发明内容

本发明的目的主要是提供一种扩增效率高、准确度高的检测特异性某特定位点的定量PCR精准检测技术。

本发明通过下述技术方案实现：

含有gat-tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测的引物和探针：

上游引物序列，gat-tpinⅡ-F1：5'-AGTTRGGMTTCAGYGAGCARGGAGA-3'；

下游引物序列，gat-tpinⅡ-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTC-3'；

荧光探针序列，

gat-tpinⅡ-P2：5'-FAM-CCKCCAGTWGGACCTCACATCCTGATGTAT-TAMRA-3'。

上述含有gat-tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测方法，包括以下步骤：

(1)合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，

上游引物序列，gat-tpinⅡ-F1：5'-AGTTRGGMTTCAGYGAGCARGGAGA-3'；

下游引物序列，gat-tpinⅡ-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTC-3'；

荧光探针序列，

gat-tpinⅡ-P2：5'-FAM-CCKCCAGTWGGACCTCACATCCTGATGTAT-TAMRA-3'；

(2)制备DNA稀释液；