[发明专利]利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法。

背景技术

生物活性物质（Bioactive substance），是指来自生物体内的对生命过程有调控作用的一类微量或少量物质，具备以下特点：一是含量少，二是生物活性高。具备医药用途的生物活性物质是指从生物组织或生物质中提取获得的一类对人体或动物具有显著调控作用的天然组分。这些天然组分尤其是对改善人类健康有积极功效。这类生物活性物质通过提取、改性、修饰、转化成为相关产业追求的目标。

自然界的生物类群千差万别，每一种生物中都含有大量的生物活性物质，这些生物活性物质主要为生物体内的一次代谢产物与二次代谢产物。第一，这些一次代谢指植物细胞通过光合作用或微生物的代谢，生成生物体生存繁殖所必需的化合物，如糖类、氨基酸、脂肪酸、核酸及其聚合衍生物、乙酰辅酶A等的代谢过程。第二，有些是以二次代谢产物方式产生，其过程往往是以生物体本身的某些一次代谢产物作为起始原料，通过一系列生物化学反应生成的化合物是典型的生物活性物质，如萜类、甾体、生物碱、多酚类等；第三，这类二次代谢产物也可以是微生物利用植物或动物或微生物的代谢产物，转化合成而来，也可能是在植物或动物的前体或信号物质诱导下自身加快合成而来；后一种情况在药用植物及其内生菌相互作用关系中比较普遍。

从自然界中的生物体内分离提取的生物活性物质，其种类包括活性多糖、低聚糖类、功能性糖醇类、膳食纤维、功能性油脂、功能性蛋白质、功能性氨基酸与多肽、生物碱、酚类化合物、黄酮类化合物、植物甾醇类、甙类、挥发油、单宁类、皂苷类、含硫活性物等。部分生物活性物质已经可以人工合成，但是化学合成的生物活性物质往往具有旋光性差异并导致生物活性差异，往往达不到天然产物的效果，且纯化成本高。

目前制备生物活性物质的主要方法中也包括利用培养植物细胞和组织，以及其他繁殖体如原球茎和毛状根等。但是，人工培养的植物组织中天然产物的含量往往不高，达不到工业化利用的需求，且植物培养成本高，周期长。值得注意的是，药用植物内生菌也能够表达与药用植物类似或完全相同的生物活性物质，其培养周期短，成本低，甚至表达量高。但是，内生菌表达生物活性物质的水平很不稳定，往往随着继代培养代数的增加而显著降低，甚至完全丧失。

其他产生物活性物质的菌株表达生物活性物质水平随着继代培养代数的增加而显著降低的情况也比较普遍。如文章《蛹虫草菌种退化的探讨》中介绍，蛹虫草具有与冬虫夏草极相似的药理药效，可以作为冬虫夏草的代用品，但其菌株在继代培养过程中极易退化。再如文章《继代培养对球孢白僵菌毒素产生水平的影响》中报道，继代培养对球孢白僵菌生物学特性、毒力及毒力相关因素等均会产生影响，发现随着世代的增加，白僵菌某些毒素的代谢水平也逐渐降低。文章《继代培养对球孢白僵菌毒力及毒力相关酶表达的影响》也证实：随着继代次数的增多,供试菌株的表达量均呈下降趋势。

因此，在内生菌培养过程中加入药用植物因子，以保障内生菌产生生物活性物质的能力，或刺激内生菌产生相应生物活性物质是一种有效的新选择。

中国专利文献（申请号：201610647628.X）公开了一种利用人参内生真菌制备人参白茯苓发酵液的方法，其包括如下步骤：S1：用人参在内生菌诱导培养基中制备真菌；S2：分别用人参和步骤S1获得的真菌制备人参提取浸膏和真菌代谢产物浸膏，并利用所述人参提取浸膏和真菌代谢产物浸膏筛选出目标菌株；S3：利用所述目标菌株制备目标菌株种子液；S4：将所述目标菌株种子液接入由人参和白茯苓制备的发酵培养基中，在28～32℃下培养，得到所述人参白茯苓发酵液。现有公开专利一方面证明了本发明通过添加植物基材料的观点；但其所采用的方法仅限对于人参，不适用其它的植物基材料；同时，与现有技术相比，本发明先活化内生菌，提高其生物合成能力，且在共培养过程中形成优势菌群，不易污染；同时，本发明只需要一种生物基材料就可以高水平持续表达含有人参的活性成分，且发酵液更好；其次，本发明采用获得植物细胞和活的繁殖体，或部分灭活的植物组织，而不仅仅是提取物作为植物基材料，选择面更广，原材料更容易获得，实践证明在人参皂甙等活性物质的培养过程中，用本发明之方法活性更高，更稳定。