[发明专利]犬卵母细胞的体外成熟方法

说明书

本发明涉及犬卵母细胞的体外成熟(IVM)方法，尤其是涉及三阶段培养犬卵母细胞的体外成熟方法。

技术领域

本发明涉及犬卵母细胞的体外成熟(IVM)方法，尤其是涉及三阶段培养犬卵母细胞的体外成熟方法。

背景技术

犬繁殖生理与通常的其他哺乳动物有很大区别。犬是非季节单次发情动物，一年仅排卵1-2次，间隔为4-12个月。犬的繁殖周期具有较长的动情前期和发情期的特征(大约一周)，黄体期在循环的孕酮作用下平均持续2个月。至发情后期，黄体功能逐渐退化，使犬进入2-10个月的长时间乏情阶段。乏情时缺乏性行为或性腺活动，而且孕酮浓度到达最低点。从乏情中期到末期，下丘脑分泌促性腺释放激素(GnRH)增多，从而刺激促卵泡素(FSH)分泌量增加和促黄体素(LH)的释放。

FSH在开始发情前期对卵泡发生发挥重要作用，对于发情后期，LH峰促使成熟卵泡快速发育和排卵前黄体化，犬在LH峰40-50小时后排卵。发情行为和排卵是在雌激素循环下降和孕激素显著上升的作用下完成的。排卵前卵泡已经黄体化，此时大多数哺乳动物排出的卵母细胞已经成熟，处于第二次减数分裂中期(MII期)，而犬的卵母细胞第一次减数分裂才开始。由于犬排卵后的卵母细胞大部分处于GV(生发泡)期，尚未成熟，增加了其在输卵管中与精子受精的可能性，因此未成熟的卵母细胞也能受精，也能形成原核。犬科动物与它哺乳动物相比这些特殊的生殖生理特点，对于进行犬卵母细胞的体外成熟造成了相当大的难度。

国内外在犬科动物卵母细胞成熟方面均处于条件摸索阶段。1976年Mahi、Yanagimacbi首次报道了犬科动物卵母细胞的体外成熟培养，由此开始，研究人员开始对体外培养狐、犬卵母细胞进行了各种各样的尝试，例如采用TCM-199、SOF等常用的基础培养液进行培养。激素作为对卵母细胞成熟重要的影响因素，研究者进行了各种激素及激素组合的尝试，但到目前为止还没有找到合适的激素组合来提高卵母细胞的成熟率。为了提高犬卵母细胞体外达到MII期(第二次减数分裂中期)的成熟率，研究者开始尝试其它的培养方式。Hewitt(2001)首先关注输卵管环境对卵母细胞成熟的影响，用发情犬的输卵管组织与输卵管液进行与卵母细胞共培养，结果表明在共培养后减数分裂恢复率显著提高(EnglandG CW,Vemtegen JP,Hewitt DA.Pregnancy following in vitro fertilization ofcanine oocytesIJ].Vet Rec,2001,148:20-229)。Shimazu等(1993)研究证明，发情犬的输卵管上皮细胞共培养，培养48h、72h卵母细胞的成熟率能有明显的提高(48h MII期达16.7％，72h MII期达23.2％)(Yamadas,Shimazu Y,Kawano Y,et al.In vitromaturation and fertilization of dog ooeytes[J].Reprod Fertil,1993,47(SuPPI):227-235)。

研究人员虽然还在供体年龄、品种、繁殖周期、卵巢卵泡大小、培养基、体外成熟时间、添加蛋白、激素及共培养等方面对犬科动物卵母细胞体外成熟进行了研究，但是现有技术往往都是采用单一的培养方法或者单一的培养基，在成熟的不同阶段更换新鲜培养基，在单一的培养基中添加2-3种激素。虽然也有少数报道犬科动物卵母细胞的成熟分两个阶段进行，但是总的来说这样的成熟方案与其他哺乳动物采用的卵母细胞的体外成熟方法并无太大差别。然而，犬的卵母细胞在体内成熟过程是分阶段进行的，且主要以排卵后为成熟的重要阶段。因此采用单一培养基或激素配比无法模拟犬卵母细胞体内成熟的过程，无法满足犬卵母细胞体外成熟的要求，造成犬卵母细胞体外成熟率较低且质量较差，目前所有犬卵母细胞的体外成熟方案的成熟率仅为10-20％左右。

因此，非常需要开发有效提高犬卵母细胞体外成熟率的方法，也就是提高犬卵母细胞体外达到MII期(第二次减数分裂中期)成熟率的方法，从而建立犬卵母细胞的体外成熟体系，使犬成熟卵母细胞的来源更为广泛，代替原有通过手术法冲取成熟卵母细胞的方案。

发明内容