[发明专利]犬卵母细胞的体外成熟方法

权利要求书

1.犬卵母细胞的三阶段体外成熟方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：(1)以NCSU-23作为基础培养基，添加10％发情母犬血清、10ng/mL的EGF、2IU/mL的FSH、2IU/mL的LH及2IU/mL的E2，每12小时换液1次，培养包裹三层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体24小时，作为第一阶段；(2)采用NCSU-23培养基，添加0.8％的BSA、10ng/mL的EGF、10IU/mL的PMSG、10IU/mL的HCG及2IU/mL的E2，对步骤(1)获得的培养细胞继续培养24小时，作为第二阶段；以及(3)采用离子霉素及6-DMAP对卵母细胞进行化学激活，激活后，在底部培养有输卵管上皮细胞的培养皿中，采用添加0.8％BSA及10ng/mL EGF的mSOF培养基进行体外成熟24小时，作为第三阶段。

2.根据权利要求1的犬卵母细胞的三阶段体外成熟方法，其特征在于所述底部培养有输卵管上皮细胞的培养皿的制备方法为：在超净台中将输卵管从离体获得的卵巢囊表面分离，然后将输卵管的一段结扎，用1mL注射器将0.1％的I型胶原酶注入输卵管内，然后将输卵管的另一端结扎，放入培养箱中消化0.5-2h，然后用含有10％胎牛血清的内皮培养基ECM终止消化，离心去除上清液后，放入35mm培养皿进行培养，每48小时换液一次，细胞生长至90％汇合时冻存。

3.根据权利要求1或2的犬卵母细胞的三阶段体外成熟方法，其特征在于所述mSOF培养基每100mL的配方如下：NaCl，0.626g；KCl，0.05364g；MgCl₂·6H₂O，0.01017g；KH₂PO₄，0.01632g；60％乳酸钠，12.5μL；葡萄糖，0.027g；CaCl₂·2H₂O，0.025g；NaHCO₃，0.2100g；丙酮酸钠，0.0033g；谷氨酰胺，0.014615g；必需氨基酸，2％；非必需氨基酸，1％；酚红，100ml+100μl；牛血清白蛋白，0.8g；

所述NCSU-23培养基每100mL的配方如下：NaCl，0.6356g；KCl，0.0356g；MgSO₄·7H₂O，0.0294g；KH₂PO₄，0.0162g；CaCl₂·2H₂O，0.025g；葡萄糖，0.1g；谷氨酰胺，0.0146g；牛磺酸，0.0876g；亚牛磺酸，0.0546g；链霉素，0.005g；青霉素，0.0066g；非必需氨基酸，1％；酚红，100μL。