[发明专利]一种CRISPR/nCas9介导的定点碱基替换在植物中的应用

说明书

本发明公开了一种CRISPR/nCas9介导的定点碱基替换在植物中的应用。本发明提供了一种定点编辑植物基因组的系统，该系统包括BE3植物表达载体(表达由nCas9(D10A)、脱氨酶和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制蛋白组成的融合蛋白)，并以水稻OsPDS和OsSBEIIb为靶基因对该系统进行验证。结果表明，在所选的3个靶点中，均获得预期定点突变植株，在水稻中实现了碱基的精确的点突变，且效率最高达到20％左右，为农作物育种提供了一种可行的有效的碱基替换方法，在农业育种方面具有强大的应用潜力，为快速改良农作物重要农艺性状提供了基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CRISPR/nCas9介导的定点碱基替换在植物中的应用。

背景技术

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术已经成为分子生物学中最强大的工具之一。首次在细菌中发现，由sgRNA和Cas9两部分组成(Jinek et al.,2012)。CRISPR/Cas9是通过自身的核酸内切酶活性引起靶位点DNA序列双链断裂(double-strand breaks，DSBs)，然后通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组介导的修复(homology-directed repair，HDR)两种方式引入突变。NHEJ途径诱导产生的突变大部分为核苷酸的插入或缺失，造成移码突变，而HDR则由同源供体DNA介导片段插入或核苷酸修正(Jinek et al.,2012)。CRISPR/Cas9系统对靶位点的识别依赖于核酸之间碱基互补配对，可对任何紧随PAM(NGG)的20bp的靶点序列进行编辑，且其靶点在基因组中的分布频率很高，因此对于需要定点编辑的靶基因，更容易找到合适的靶位点。另外CRISPR/Cas9系统可同时对同一基因的不同位点或多个基因的位点进行定向编辑，使其运用更加灵活。此外，CRISPR/Cas9系统操作简单快捷，每次打靶只需替换原有载体上20-30bp的核苷酸序列，更适宜规模化，高通量操作(Cong et al.,2013；Feng et al.,2014；Gao and Zhao,2014；Zhou et al.,2014；Lawrenson et al.,2015；Liu et al.,2015；Ma et al.,2015；Wang etal.,2015；Xie et al.,2015；Paul III and Qi,2016)。随着CRISPR/Cas9技术在人类与动物细胞系中建立并应用，经过改造的CRISPR/Cas9系统也迅速地被应用到拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中，并且获得较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株(Shan et al.,2013；Puchta and Fauser,2014；Voytas andGao,2014；Li et al.,2015；Ma et al.,2015；Svitashev et al.,2015；Endo et al.,2016；Gao et al.,2016；Sun et al.,2016)。

尽管CRISPR/Cas9作为一种新的靶向基因修饰技术，展现了广阔的发展潜力和应用前景，并在农作物改良中得到广泛应用，但目前主要局限于基因随机突变和敲除。农作物中含有大量农艺性状是由单碱基的突变导致，传统CRISPR/Cas9技术引入DSB后，与非同源末端连接的随机过程相比，HDR总是以相当低的频率发生，只有少数报道表明CRISPR/Cas9介导的HDR在作物中可行(Li et al.,2015；Svitashev et al.,2015；Endo et al.,2016；Shi et al.,2016；Sun et al.,2016)，使得大量农艺性状无法得到快速的改良。