[发明专利]一种对香豆酸-3-羟化酶及其编码基因与应用

说明书

本发明涉及对香豆酸‑3‑羟化酶及其编码基因与应用。本发明首次揭示了石蒜属植物忽地笑的对香豆酸‑3‑羟化酶，其具有良好的底物专一性和区域选择性，可以催化对香豆酸的3位C的羟基化生成咖啡酸。本发明还揭示了编码所述对香豆酸‑3‑羟化酶的多核苷酸，表达所述对香豆酸‑3‑羟化酶的载体与宿主细胞，以及生产咖啡酸的方法。

技术领域

本发明涉及生物技术和植物生物学领域；更具体地，本发明涉及一种来源于石蒜科植物的对香豆酸-3-羟化酶及其编码基因与应用。

背景技术

植物细胞色素P450酶(Cytochrome P450 enzymes，CYPs)参与大量植物天然产物的生物合成，是天然产物生物合成的关键酶之一，属于亚铁血红素单加氧酶超大家族，催化多种类型的氧化还原反应，具有结构选择性、区域选择性和立体选择性。CYPs的催化活性依赖于细胞色素P450还原酶。细胞色素P450还原酶可以将电子供体(还原力)中的电子传递给CYPs，协助CYPs进行一系列的结构专一性、区域专一性和立体专一性生物反应。

对香豆酸-3-羟化酶是植物细胞色素P450酶，属于CYP98亚家族，催化对香豆酸3位C的羟基化生成咖啡酸。作为一种苯酚衍生物，咖啡酸是植物苯丙素类天然产物，具有抗氧化、抗病毒、抗癌及抗炎等多种生物医药活性，用于临床及医药、食品和化妆品等行业。在临床上，咖啡酸用于预防手术时出血以及出血性疾病的止血。在医药上，咖啡酸是一种止血升白细胞药，具有收缩微血管、提高凝血因子以及升高白细胞和血小板的作用，用于白细胞减少症和血小板减少症等。在化妆品中，低浓度的咖啡酸具有抑制皮肤黑色素生成的效用。作为一个多功能的药效基团和平台化合物，咖啡酸还可以衍生出大量具有医药活性的化合物。例如，咖啡酸是蜂胶主要活性成分之一——咖啡酸苯乙酯和金银花主要抗菌、抗病毒有效药理成分之一——绿原酸等物质合成的前体物质，还可以用于临床上治疗轻、中度老年痴呆症的药物——加兰他敏的合成。咖啡酸具有广泛的应用和需求。

忽地笑(Lycoris aurea)是多年生草本球根药用植物，属于石蒜科石蒜属，能够合成咖啡酸等具有重要生物活性和应用价值的大量植物天然产物。但是，石蒜属植物对香豆酸-3-羟化酶及其编码基因尚未被分离与克隆。因此，本领域有必要开发石蒜属植物忽地笑的对香豆酸-3-羟化酶。该蛋白及其编码基因可通过植物转基因和异源表达的方式进行咖啡酸的生物转化与生物合成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种石蒜科植物的对香豆酸-3-羟化酶，所述的对香豆酸-3-羟化酶选自：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质；或

(b)将SEQ ID NO：1氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个)氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的，且具有对香豆酸-3-羟化酶活性的由(a)衍生的蛋白质；或

(c)与SEQ ID NO：1氨基酸序列有至少75％序列相同性，且具有对香豆酸-3-羟化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明SEQ ID NO：1所示的蛋白质是从忽地笑(Lycoris aurea)中分离得到的一种新的对香豆酸-3-羟化酶(p-Coumaric acid-3-Hydroxylase)。为便于表述，将SEQ IDNO：1所示的蛋白质命名为LaC3H。

在一个优选例中，所述的对香豆酸-3-羟化酶活性是指以对香豆酸为底物合成咖啡酸。

在另一个优选例中，所述的序列(c)还包括：由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。

本发明的另一目的在于提供分离的多核苷酸，该多核苷酸是编码所述对香豆酸-3-羟化酶的多核苷酸。

在一个优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。