[发明专利]一种同步检测4种辣椒病毒的多重PCR方法

权利要求书

1.一种同步检测BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种辣椒病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR体系中，包含有如下特异性引物：

扩增BBWV2的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5′-GCGTCCTGAGTTTGTTGTAGCG-3′，

SEQ ID NO.2：5′-CCTCCATCAAGCCTTGACCATATC-3′；

扩增PVY的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.3：5′-CGGTTCGTTTGAATGCAAGC-3′，

SEQ ID NO.4：5′-CTTGCTGCTTCTCCCCTATGG-3′；

扩增ChiVMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.5：5′‐TGGCTGTGCAAGTTACCTTC‐3′，

SEQ ID NO.6：5′‐ACCTGTGTGATGACGTGGGT‐3′；

扩增CMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.7：5′-AAANCTTGTTTCGCGCATTCA-3′；

SEQ ID NO.8：5′-GAGGGAGGGTTCTGGGAACA-3′。

2.根据权利要求1所述的方法，所述PCR体系中BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV引物的摩尔比分别为2.5：1：2.5：1。

3.根据权利要求2所述的方法，所述的PCR体系总体积25μL，其中含有cDNA 2μL、10mMdNTPs 3μL、rTaq 1.5U、25mM的MgCl₂ 1.5μL以及10μmol/L的BBWV2、PVY、ChiVMV及CMV上下游引物分别为0.5μL、0.2μL、0.5μL、0.2μL。

4.根据权利要求3所述的方法，所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒、57℃退火45秒和72℃延伸90秒，共40个循环；最后72℃延伸10分钟。

5.根据权利要求1－4任一所述的方法在同步检测农作物中四种辣椒病毒病原BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，所述农作物为辣椒。

7.一种检测试剂盒，含有检测BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四种辣椒病毒的引物，其分别为：

扩增BBWV2的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5′-GCGTCCTGAGTTTGTTGTAGCG-3′，

SEQ ID NO.2：5′-CCTCCATCAAGCCTTGACCATATC-3′；

扩增PVY的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.3：5′-CGGTTCGTTTGAATGCAAGC-3′，

SEQ ID NO.4：5′-CTTGCTGCTTCTCCCCTATGG-3′；

扩增ChiVMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.5：5′‐TGGCTGTGCAAGTTACCTTC‐3′，

SEQ ID NO.6：5′‐ACCTGTGTGATGACGTGGGT‐3′；

扩增CMV的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.7：5′-AAANCTTGTTTCGCGCATTCA-3′；

SEQ ID NO.8：5′-GAGGGAGGGTTCTGGGAACA-3′。