[发明专利]一种弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒

说明书

本发明公开了一种弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒；所述诊断试剂盒中所用的检测抗原为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的弓形虫TgPP1基因原核表达获得的重组蛋白rTgPP1。本发明的试剂盒的包被抗原是原核表达的rTgPP1蛋白，在低温诱导下，它以可溶性的形式存在，而且在N端带有His标签，这有利于大量纯化rTgPP1蛋白，从而使抗原来源不再受约束；本发明使用重组抗原代替天然抗原作为包被抗原，应用于ELISA检测以及制备ELISA试剂盒，可以显著提高不同批次间抗原的稳定性，还具有较好的特异性和重复性，为流行病学调查和疾病诊断提供了一种快速有效的检测方法。

技术领域

本发明涉及一种优化的弓形虫TgPP1基因和一种弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒。

背景技术

弓形虫病(toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的人兽共患寄生虫病，弓形虫属顶端复合门(Apicomplexa)、类锥体纲(Conoidasida)、球虫亚纲(Coccidia)、真球虫目(Eucoccidiorida)、艾美耳亚目(Eimeriorina)、肉孢子虫科(Sarcocystidae)、弓形虫属(Toxoplasma)，是一种细胞内寄生性原虫，可寄生在除红细胞外几乎所有有核细胞中，呈全球性分布。据血清学统计分析，全世界约25％～50％的人感染弓形虫。弓形虫可造成人体多种器官病理损害，甚至危及生命。免疫功能正常的宿主感染后多呈无症状带虫状态；对于免疫损伤和缺陷的个体，如艾滋病患者，其感染可能是致命的，孕妇感染可致流产、早产、死胎或畸胎。弓形虫主要通过口、母婴和血液传播感染宿主。

由于弓形虫病的临床症状无明显特异性，且多呈现隐性感染，故依据临床症状和流行病学难以作出诊断。目前弓形虫病主要依据实验室诊断，主要方法有病原学检查、免疫学检测和分子生物学技术。病原学检查是从病料中直接检查速殖子或卵囊，主要包括：直接涂片或组织切片检查、动物接种和卵囊检查法；免疫学检测包括：染色试验、间接血凝试验、乳胶凝集试验、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)等；分子生物学方法主要指PCR技术。血清学诊断方法是目前弓形虫病检测的主要手段，其中ELISA法具有操作简便、灵敏性高、快速、易标准化等特点，已成为首选的常规诊断方法，所用抗原大多为表面蛋白或分泌蛋白等可溶性抗原。然而目前我国市场上销售的弓形虫病诊断试剂盒品种繁杂、质量参差不齐，既无统一标准，又无序生产与使用，给弓形虫病的诊断与防治造成严重危害。综合起来，我国弓形虫病诊断试剂盒存在交叉反应严重、敏感性和特异性低、符合率不高等问题。

弓形虫入侵宿主时，要通过速殖子(tachyzoite)顶端复合体接触宿主细胞膜，借助随后分泌的一些分泌蛋白侵入细胞、形成带虫空泡(parasitophorous vacuole)，并在胞浆或细胞核内进行内裂殖、二分裂和玫瑰花斑式繁殖，最终裂解细胞，又侵入新的宿主细胞进行不断地发育和繁殖，同时也导致宿主细胞不断的破坏而致病。此过程依赖于磷酸化和脱磷酸化作用，这些蛋白修饰是囊泡运输(vesicular trafficking)、分泌，以及肌动蛋白-肌球蛋白动力等的信号通路调节因子。早在1997年，Dobrowolski等即发现，肌球蛋白轻链激酶(Myosin light chain kinase)抑制物KT5926影响弓形虫速殖子的移动和对宿主细胞的黏附。Delorme等(2002)发现，I型和2A型蛋白磷酸酶(protein phosphatase，PP)的抑制物冈田酸(okadaic acid，OA)、泰托霉素(tautomycin)能明显地影响I型弓形虫速殖子的入侵，抑制率可达50％左右；速殖子的可溶性提取物具有I型蛋白磷酸酶(proteinphosphatase 1，PP1)的活性，且可与抗人PP1催化亚单位抗体反应；体外磷酸盐标记试验证实，弓形虫PP1能催化多种蛋白的磷酸化反应。

目前，国内外还没有学者运用重组TgPP1(recombinant TgPP，rTgPP1)蛋白建立猪弓形虫病的ELISA诊断技术。

发明内容