[发明专利]一种肝原代细胞分离制备方法

说明书

本发明公开了一种肝原代细胞分离制备方法，所述肝原代细胞分离制备方法中采用复合酶对肝脏进行灌注分离制得肝原代细胞。本发明属于医学生物技术领域，本发明的肝原代细胞分离制备方法能够有效分离肝原代细胞，复合酶的共同作用使得每种细胞的不同表面生长基质都能够得到充分的酶解，从而得到单个的细胞悬液。缓冲体系的配合为复合酶的作用提供了适宜的环境，使得酶解更为完全，从而提高分离肝原代细胞的得率。复合酶的催化特性及缓冲体系为细胞生活提供了必要环境，使得分离得到的肝原代细胞具有较高的存活率。

技术领域

本发明涉及医学生物技术领域，尤其涉及一种肝原代细胞分离制备方法。

背景技术

肝脏作为机体的重要器官，在代谢、消化、解毒、凝血、免疫、调节等方面均起着非常重要的作用。肝脏由肝细胞组成，肝细胞行使了肝脏主要的功能，如清除毒素、参与生物合成和生物转化、代谢多种营养物质、储存葡萄糖、分泌具有促进肝细胞生长的活性物质等。从机体分离得到肝细胞有助于药理毒理学、免疫学、细胞生物学等体外研究，而且随着生物人工肝在治疗肝衰竭领域的应用，越来越需要大量、高活性的原代肝细胞作为生物材料。因此，如何分离制备高产量、高纯度、高存活率、形态完整、体外代谢活性高的原代肝细胞受到研究者的广泛关注。

自1953年Anderson创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进。在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流的方法。其中，非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应用的要求。1969年，Berry和Friend引入了肝脏灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高。自从引入灌流法分离肝细胞以来,许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良。其中Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法。两步灌流法主要是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法。许多学者在具体操作中, 不断改进两步灌流法的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率。

然而，尽管两步灌流法在实际应用中也经过了无数次改良，但始终没有摆脱采用单一胶原酶进行灌注的观念。而肝脏是由实质细胞（肝原代细胞）和非实质细胞构成，其比例为3：2。肝脏的复杂性在于非实质细胞包括：星状细胞，窦内皮，胆管上皮和免疫细胞（淋巴细胞和粒细胞），而整个肝脏组是由60%实质细包和40%非实质细胞交错分布组成一个大的网络结构，单一酶解达不到很好的效果，因此，有必要对现有技术中的肝原代细胞分离制备方法进行改进。

发明内容

本发明为克服上述现有技术所述的至少一种不足，提供一种的肝原代细胞分离制备方法，分离制备高产量、高纯度、高存活率、形态完整、体外代谢活性高的肝原代细胞。

为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种肝原代细胞分离制备方法，采用复合酶对哺乳动物肝脏进行灌注分离制得肝原代细胞。

本发明摆脱原有使用单一酶灌注分离肝原代细胞的思维，根据不同肝细胞的表面特性使用复合酶进行灌注，解决分离肝原代细胞中血液干扰和组织特异性问题，得到可传代培养的肝原代细胞。肝脏是由肝细胞组成，并有丰富的血管网，呈红褐色，质软而脆，易受暴力打击而破裂，导致传统机械法分离肝原代细胞得率和存活率十分低下而极少人使用。一般酶解法由于血管网丰富而导致酶的合力低下，另外，肝脏组织中各类细胞交错分布，单一酶解达不到很好的效果。复合酶的共同作用使得结构复杂、每种细胞表面生长基质不同的肝脏能够被充分酶解而得到单个细胞，而且该过程不会破坏周围的血管网，使得复合酶酶解得到的肝原代细胞具有较高存活率和较高得率。复合酶的用量根据动物肝脏的大小来确定，一般每克动物肝脏用30~60mg复合酶进行酶解。