[发明专利]一种使用纳米探针穿入细胞核的方法

说明书

该发明公开了一种使用纳米探针穿入细胞核的方法，涉及细胞生物学与细胞转染领域，首先通过FIB技术加工一种高长径比的纳米探针，同时在细胞膜表面添加一层鼠尾胶原蛋白以此减少细胞骨架对纳米探针的扰动，然后利用该纳米探针与单个细胞作用记录所有的力曲线，最后利用编写的程序自动化分析力曲线，判断纳米探针是否穿透了细胞核，并记录需要读取的数据。利用该方法可以自动化地对力曲线进行系统分析，不仅可以减少人力，而且这些数据的统计分析对未来纳米技术智能穿透细胞核有重要的参考意义。

技术领域

本发明涉及细胞生物学与细胞转染领域。

背景技术

细胞转染方法分为生物转染（慢病毒转染和腺病毒转染）、化学转染（脂质体转染）和物理转染（电穿孔、显微注射和纳米探针技术），每种方法都有各自的优缺点。目前普遍使用的方法是生物转染和化学转染方法，但是转染后的细胞存在癌变风险，而且细胞毒性增大。以上两种方法最大的缺陷在于转染效率非常低，不超过0.1%。物理转染方法安全可靠，这也是近几年大量科学家研究细胞转染的重要方法。在物理转染方法中，电穿孔可以高通量的对细胞进行转染，但是高电压会造成大量的细胞死亡，并且转染过程不可控；显微注射法可以在时间和空间上对细胞进行可控转染，但是很难对贴壁细胞进行直接转染。目前更多的研究者开始关注基于纳米探针技术的细胞转染方法。该方法可以实现直接对贴壁细胞进行单细胞转染，时间和空间可控，可原位观察转染后细胞的生物学特性。日本在2008年首先提出了利用一种高长径比的纳米探针来穿透细胞核，并在随后很多年一直从事这方面的研究，证明了这种纳米探针对细胞转染的可靠性。该方法转染效率高，但是问题在于，这种高长径比的纳米探针非常敏感，在刺入细胞的时候容易和细胞骨架相互作用使得得到的力曲线抖动很大（图1），这在很大程度上增加了力曲线分析的难度。而且目前对力曲线的数据读取几乎靠人力，数据量庞大，迄今为止都没有研究团队对实验中穿透细胞核的力曲线参数如刺穿力、刺穿位置、力曲线跳变大小等做过系统的统计，这会阻碍利用纳米技术智能化转染细胞的进程。

发明内容

本发明针对背景技术的不足之处设计一种使用纳米探针穿入细胞核的方法，解决现有技术中纳米探针穿刺成功率低的问题。

本发明技术方案为首先需要在试验前对细胞进行处理，在一定程度上“固定”细胞骨架，减少其对探针的扰动以得到较为标准的力曲线；本发明将细胞膜表面添加鼠尾胶原蛋白是为了让鼠尾胶原蛋白和细胞膜表面的跨膜蛋白作用，而跨膜蛋白又和细胞内的细胞骨架相互作用。通过这种间接的作用可以一定程度上“固定”细胞骨架，以减少探针在穿透细胞过程中骨架对探针的扰动，从而得到较为平滑的力曲线。其次是编写相应程序利用计算机智能读取穿透细胞核的力曲线数据，以此全面了解探针穿透细胞核的过程，为下一步智能化转染细胞提供依据。因此本发明一种使用纳米探针穿入细胞核的方法，该方法包括：

步骤1：对现有纳米探针进行加工；

步骤1.1：获取待加工金字塔形氮化硅探针的俯视图形区域，计算出该俯视图形的轮廓；

步骤1.2：采用离子束沿俯视图形的轮廓线逐层剥落金字塔形氮化硅探针各腰面的氮化硅；

步骤1.3：当加工后探针的俯视图形的轮廓与原金字塔形氮化硅探针的针尖轮廓重合时停止进一步加工；获得纳米探针。

步骤2：对待穿透细胞进行处理：将鼠尾胶原Ⅰ型蛋白附着于待穿透细胞的细胞膜表面；

步骤3：进行细胞穿透；

步骤3.1：将探针对准待穿入的细胞核，进行下针，检测探针上受力情况；

步骤3.2：监测探针受力变化，若探针出现两次受力突变则判断探针穿入了细胞核。

进一步的，所述步骤1.2中采用电压为60kv,束流为0.28nA的离子束沿俯视图形的轮廓线逐层剥落金字塔形氮化硅探针各腰面的氮化硅；