[发明专利]一种用于猪孤雌激活胚的体外培养液及培养方法

说明书

本发明公开了一种用于猪孤雌激活胚的体外培养液(mPZM‑3)及培养方法，属于动物胚胎体外培养领域，所述体外培养液(mPZM‑3)的原料包括mPZM‑3基础培养液及五水乳酸钙和丙酮酸钠，且所述体外培养液中五水乳酸钙的浓度为0.606g/L，丙酮酸钠的浓度为0.022g/L；所述体外培养液所用溶剂为富氢水，且其中H₂的含量为1.2～1.6ppm；所述体外培养液用于猪孤雌激活胚的培养方法为：先将猪孤雌激活胚胎用含5μmol/L细胞松弛素B的体外培养液洗涤并在其中处理3～5h，再用未添加细胞松弛素B的体外培养液洗涤并在其中培养168h，至胚胎发育成囊胚。本发明能保证较好地为猪孤雌激活胚胎提供能量和发育环境，从而提高其胚胎培养质量和效果。

技术领域

本发明涉及动物胚胎体外培养领域，具体的涉及一种用于猪孤雌激活胚的体外培养液及培养方法。

背景技术

动物胚胎的体外培养是胚胎生物技术中的重要环节。在体外培养条件下，早期胚胎往往不能完成从受精卵到囊胚的发育全过程，而停顿在某个特定发育时期，这一现象被称为胚胎体外发育阻断(in vitro block of embryonic development)，因而严重影响早期胚胎体外发育质量，如猪体外囊胚发育率一般仅为20％左右，内细胞团数量在30个左右，导致后代的出生率下降，极大地阻碍了猪在农业、生物工程和医学中的研究应用。

动物胚胎的体外培养与三方面的因素有关，即胚胎种类、培养条件和培养液的成分，其中培养液成分的改进是体外培养技术的基础和关键环节所在，直接影响到体外培养效果和体外生产胚胎的质量。

孤雌激活胚胎是将卵母细胞激活后，使其能完成成熟分裂，并由此向有丝分裂过渡，开始新的个体发生。对哺乳动物孤雌激活的研究，将加深对胚胎发生、核移植等许多重大理论问题的认识。孤雌激活的成功，对野生动物保护、转基因动物制作以及生物发育机制的深入研究等也具有重要的理论和现实意义。

目前，现有的用于猪孤雌激活胚的体外培养液及培养方法不能保证卵母细胞的激活稳定，不能较好地为细胞代谢提供所需能量，且不足以获得较高的胚胎培养质量和效果。

发明内容

1.要解决的技术问题

本发明要解决的技术问题在于提供一种促进胚胎体外发育的用于猪孤雌激活胚的体外培养液及培养方法。

2.技术方案

为解决上述问题，本发明采取如下技术方案：

一种用于培养猪孤雌激活胚胎的体外培养液，所述体外培养液的原料包括mPZM-3胚胎培养液及五水乳酸钙和丙酮酸钠，且所述体外培养液中五水乳酸钙的浓度为0.606g/L，丙酮酸钠的浓度为0.022g/L；所述体外培养液所用溶剂为富氢水，且其中H₂的含量为1.2～1.6ppm。

进一步地，所述mPZM-3胚胎培养液的原料包括mPZM-3基础培养液、L-谷氨酰胺、亚牛磺酸、L-半胱氨酸、青霉素、硫酸链霉素以及牛血清白蛋白，且它们的配比为1L：0.146g：0.546g：0.069g：100000IU：70000IU：3g。

更进一步地，所述mPZM-3基础培养液包括如下浓度的溶质：氯化钠6.312g/L，碳酸氢钠2.119g/L，氯化钾0.746g/L，磷酸二氢钾0.048g/L，硫酸镁0.048g/L；还包括2％的必需氨基酸和1％的非必需氨基酸。

对于猪孤雌激活胚胎，所述体外培养液中富氢水的H₂浓度以1.4ppm效果较好。

本发明还提供了上述体外培养液用于培养猪孤雌激活胚胎的方法，包括如下步骤：

(1)将猪孤雌激活胚胎在含5μmol/L细胞松弛素B的体外培养液中洗三次，移入含5μmol/L细胞松弛素B的体外培养液中培养3～5h；