[发明专利]可控性HIV‑1基因组靶向编辑系统和其靶向载运系统

说明书

技术领域

本发明属于基因组编辑技术领域，具体涉及HIV-1介导的基因组编辑和pDNA药物靶向输送系统。

背景技术

目前随着基因的靶向操作技术的进展，清除外源感染病毒基因组或者改造自身体内某些有害基因的梦想逐渐成为现实，比如TALEN技术和CRISPR技术。二者各有优缺点，比如TALEN技术脱靶率很低，限于靶向性的DNA元件较大，超出多数载体的容量，因而很难用于多重打靶；而CRISPR技术仅采用一个核酸切割酶CAS9，搭载多个gRNA，可以实现多靶位切割，但是目前CRISPR存在一个缺点，即脱靶效应，对非特异性位点序列的切割会引起较大的潜在危险。spCAS9为细菌(化脓链球菌)蛋白，其在人体细胞内长期表达，将对机体基因组造成一定的威胁和激活细胞内部的免疫抗原提呈的风险。在制作基因靶向药物的时候要么需要短时表达，要么实现可控表达，而实现短时表达的策略，可以使用质粒DNA载体技术，在机体内作非整合型表达，该方法的质粒在细胞内表达时间短，会影响spCAS9的切割效果，对此需要提高质粒在细胞内的存留时间。目前虽然出现了一些附加体(episome)技术具有此能力，但目前所使用的附加体均来自于病毒，需要表达一些病毒蛋白以维持附加体的复制，但这些病毒蛋白对细胞具有较大的潜在危害，比如具有一定的致癌潜力，大大限制了其临床使用范围。为此整合型的质粒具有稳定的表达，如果实现可控性表达，将解决CAS9切割效果不足的缺点。但整合型的质粒一般需要特定的酶来介导，目前一般采用病毒介导的转入和整合，使用病毒载运DNA至细胞内，具有高效稳定的优点，但是也存在细胞非特异性感染、基因组随机整合、病毒的抗原性高、病毒感染的细胞特异性低、病毒制作繁琐、不易储运等缺点。随机整合的病毒对附近基因的表达造成干扰，引起基因的表达增加、突变或失活，在临床上面临一定的风险，限制门槛相对较高。比如腺相关病毒AAV对AAVS1位点的定点整合效率非常低，而其他病毒，比如慢病毒，基本没有定点整合的特点。

鉴于上述的pDNA药物的载运缺点，对于一些特殊基因的靶向修饰和切割，现有技术没法实现定点整合，那么我们可以考虑降低非特异性细胞的药物载入和整合，仅将特异性整合局限于特定细胞群，这样就大大降低了发生非特异性整合的细胞范围，降低了相关药物的危险性。比如，针对艾滋病毒HIV-1的靶向CRISPR元件，如果实现仅在病毒感染的细胞中整合，那么就可以大大降低对非感染细胞的危害。病毒介导的特异性靶向，目前可以对病毒的衣壳蛋白作靶向性工程修饰，使其只对某些细胞表面受体具有亲和力，从而实现对表达特定受体的细胞进行整合。但HIV-1对CD4、CCR5和CXCR4结合的衣壳蛋白gp120在病人中有可能会出现中和抗体，而HIV-1自身的衣壳蛋白包被的病毒粒子比较脆弱，不耐纯化操作和保存，在一定程度上限制了其用于靶向性病毒介导的DNA输入和整合。因此人们采用了来自水泡型口炎病毒的衣壳蛋白VSVG，不仅增加了稳定性还增强了感染力和安全性，但由此也失去了对CD4阳性细胞感染的特异性和大大降低了对某些CXCR4阳性的淋巴干细胞的浸染能力，而使用麻疹病毒MV衣壳蛋白包被的慢病毒可以对上述T细胞具有一定的浸染能力，但是人群中对该病毒衣壳蛋白存在较大的免疫抵抗力，限制了其广泛应用。而且相当一部分HIV-1病毒会进入淋巴系统，感染CXCR4阳性的T淋巴祖细胞，尤其到感染的后期反弹阶段，这些CXCR4阳性的淋巴细胞成为病毒潜藏和不断向血液补充和释放病毒粒子的窝藏之地，而传统的化学药物对此也力不从心。对此，对于HIV-1的基因组靶向切割的CRISPR靶向元件，开发一种能够只整合那些HIV-1阳性的细胞而且安全性又高的载体技术，将具有重要的应用价值。