[发明专利]一种双酶偶联‑化学法合成ε‑己内酯的工艺

说明书

技术领域

本发明属于化学－酶催化技术领域，具体涉及一种双酶偶联-化学法合成ε-己内酯的工艺，即利用葡萄糖氧化酶(GOD)/南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)双酶交联酶聚集体催化葡萄糖氧化和酰基供体过水解藕联反应原位产生过氧酸，进而利用过氧酸氧化环己酮生成己内酯(ε-CL)的工艺。

背景技术

ε-己内酯是一种用途十分广泛的有机合成中间体，可用于生产合成纤维、塑料、薄膜、涂料和增塑剂等，特别是由ε-己内酯或与其他单体聚合所得到的聚己内酯(PCL)是一类完全可降解的高分子材料，具有良好的生物相容性、无毒性和良好的渗药性，在生物医学工程中获得良好的应用。

当前工业生产己内酯的主要方法是化学拜尔-维利格(Baeyer-Villiger)氧化法，即在50℃常压下利用过氧酸为氧化剂氧化环己酮来制备ε-己内酯(H.A.Wittcoff,B.G.Reubeu,J.S.Plotkin(Eds.),Industrial Organic Chemicals,John Wiley，NJ，2004,292pp)。这种方法的主要问题是过氧酸在储存和运输过程中存在爆炸的风险，通常Baeyer-Villiger氧化法制备ε-CL最常用的过氧化物是无水过氧乙酸，但市场上只有过氧乙酸的水溶液可供应。因此，寻找经济、安全、高效的己内酯合成方法具有重要意义。

中国专利CN 102408404 B公开了一种由分子氧氧化环己酮制备ε-己内酯的方法，该法以过量的氧气为氧化剂，并加入助氧化剂苯甲醛和引发剂偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰或其混合物，在30-55℃加热搅拌反应7-28h，经旋转蒸发，柱层析分离，最终得到ε-己内酯产物，产率最高为85.1％。这种方法的问题在于需要加入助氧化剂和引发剂，操作复杂且苯甲醛、偶氮二异丁腈均有毒，过氧化苯甲酰极不稳定，三者均易燃，存在操作安全性问题；CN102351836A公开了一种以环己酮为原料，H₂O₂为氧化剂，苯甲腈为溶剂，CaO或Al₂O₃为催化剂，在60-80℃反应1-7h，制备己内酯的工艺。但此工艺所用催化剂需要高温长时间活化或浸渍处理，不利于大规模制备。

酶催化的拜尔-维利格氧化法是制备己内酯的另一途径。该法利用拜尔-维利格单加氧酶(BVMOs)为催化剂，分子氧为氧化剂，催化环状酮氧化生成内酯(K.Balke,M.Kadow,H.Mallin,S.Sass,U.T.Bornscheuer,Discovery,application and protein engineering Baeyer-Villiger monooxygenases organic synthesis.Org.Biomol.Chem.2012,10,6249–6265)。然而，大多数催化拜尔-维利格反应的单加氧酶都需要以NADPH为辅酶，FAD为辅基。而NADPH的循环使用困难。而且，此类酶的稳定性较差，反应产率较低，缺乏商品化酶制剂这些问题都极大限制了拜尔-维利格单加氧酶的工业应用。Mallin等(H.Mallin,H.Wulf,U.T.Bornscheuer,A self-sufficient Baeyer–Villiger biocatalysis system for the synthesis ofε-caprolactone from cyclohexanol,Enzyme and Microbial Technology 53(2013)283-287)将一种重组表达的热稳定性多元醇脱氢酶(PDH-loopN)和来源于醋酸钙不动杆菌的环己酮单加氧酶(CHMO)用Relizyme^TM HA403载体进行共固定化，制备了多元醇脱氢酶-环己酮单加氧酶共固定化酶，并用其在pH9.0条件下催化环己醇合成ε-己内酯，转化率为34％。同时，他们还用多元醇脱氢酶-环己酮单加氧酶游离酶体系催化环己醇进行了反应，ε-己内酯收率为55％。该体系以环己醇为起始底物构建了辅酶循环自满足体系，无需添加额外的辅助底物即可实现辅酶NADPH循环。但不足是，固定化过程中CHMO活力损失较大，导致所得固定化酶催化能力显著降低，转化率仅为34％。而游离酶催化时，效果虽然有所改善，但ε-己内酯收率也不高，而且游离酶稳定差，不易回收，很难反复利用，造成反应成本高，不适合工业化应用。中国专利CN104195194A公开了一种双酶法生产ε-己内酯工艺，该工艺利用醇脱氢酶和环己酮单加氧酶共固定化酶或游离酶为催化剂，以空气为氧化剂，以磷酸盐缓冲液-乙酸丁酯两相体系为反应介质，将环己醇直接氧化合成ε-己内酯。该体系也存在上述类似的问题，即使用载体固定化法进行两种酶的共固定化，其过程操作繁琐，酶活力损失大，反应成本高，游离酶催化虽然避免了固定化过程，但也存在稳定差、不易回收等问题，从而限制了其工业规模的应用。