[发明专利]一种哈茨木霉酸性蛋白酶P6281的异源表达及纯化方法

说明书

本发明公开了一种哈茨木霉酸性蛋白酶P6281的异源表达及纯化方法。通过提取哈茨木霉的RNA反转录获得cDNA，通过PCR获得酸性蛋白酶基因并插入到表达载体中，重组质粒电转化导入毕赤酵母GS115进行诱导表达，再利用镍柱亲和层析和分子筛层析获得较纯的酶产物。本发明首次成功表达纯化了哈茨木霉酸性蛋白酶P6281，该方法提高了P6281蛋白酶的产量，且获得的酸性蛋白酶酶活远高于现有的木霉属酸性蛋白酶。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种哈茨木霉酸性蛋白酶P6281的异源表达及纯化方法。

背景技术

哈茨木霉是一种存在于几乎所有土壤中的木霉属真菌，它们易于定殖植物根，一些菌株具有根际活性，即能够在根发育时在根上生长。同时哈茨木霉也会通过攻击，寄生其他真菌等方式来获得营养。经过多年的进化，它们已经发展出用于其它真菌的攻击和用于增强植物和根生长的许多机制。作为一种经济有效、安全可持续的菌剂，哈茨木霉也用作杀真菌剂，是目前广泛应用于植物真菌病生物防治的一个最重要生防菌，其抑菌的作用机制和应用研究已经备受关注。它用于叶面施用、种子处理和土壤处理以抑制各种引起疾病的真菌病原体的生长。目前市场上商业生物技术产品如3Tac、T-22、G-41等已经用于治疗葡萄孢属、镰孢属和青霉属引起的真菌性土传病害。目前研究推测哈茨木霉的抑菌机制有竞争、重寄生、抗生素和刺激宿主免疫等，其中又以重寄生作用最具研究意义。目前其重寄生的机制的研究并不十分清晰，大多数科学家推测其分泌的几丁质酶、葡聚糖酶及蛋白酶等能破坏病原真菌细胞壁，而使其根植在真菌上重寄生。

在研究哈茨木霉重寄生作用的机制研究中，2005年Suarez等的研究发现，在培养基中添加灰葡萄孢提取的细胞壁组分后，在哈茨木霉分泌蛋白2D电泳中，可见多种蛋白的表达明显上调，蛋白酶P6281就是其中之一。随后他们通过质谱获得这个蛋白酶部分序列，再通过PCR获得该基因的全长，然后根据蛋白质序列分析获得P6281的理论分子量、等电点、糖基化位点或活性中心等信息。2007年Suarez对哈茨木霉EST序列中发现了61种蛋白酶，其中也包含了P6281。2009年Samolski通过microarray芯片也发现在添加几丁质的培养基中，哈茨木霉也有大量基因表达上调，其中也有p6281。2013年Szabo也报道了在线虫卵上寄生的哈茨木霉中该基因的表达。由此可见P6281可能是哈茨木霉寄生其他真菌和线虫卵过程中的一个重要蛋白酶。然而到目前为止，尚未有人分离纯化过哈茨木霉的P6281蛋白酶，对其性质并没有清楚的研究。

而在目前已有报道中，异源表达纯化得到的木霉属酸性蛋白酶酶活普遍不高，例如，2007年Liu在酿酒酵母表达的哈茨木霉SA76酸性蛋白酶发酵液酶活为10.5U/mL，2010年Guo在酿酒酵母表达的粗糙链孢菌酸性蛋白酶发酵液酶活为6.8U/mL，2013年Yang在毕赤酵母表达的棘孢木霉酸性蛋白酶发酵液酶活为18.5U/mL，2014年Dou在大肠杆菌表达的棘孢木霉ASP55酸性蛋白酶纯酶液酶活为9.52U/mL。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种哈茨木霉酸性蛋白酶P6281的异源表达及纯化方法。本发明以哈茨木霉为来源，采用了基因工程的技术方法，从木霉中获得酸性蛋白酶基因p6281，构建重组质粒，然后在毕赤酵母中重组表达，通过亲和层析和分子筛层析对发酵液中的酸性蛋白酶组分进行纯化，首次成功表达纯化了哈茨木霉酸性蛋白酶P6281。

本发明的另一目的在于提供所述方法制得的酸性蛋白酶。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种哈茨木霉酸性蛋白酶P6281的异源表达及纯化方法，包括如下步骤：

(1)培养哈茨木霉；

(2)提取哈茨木霉总RNA；

(3)RT-PCR克隆p6281编码序列；

(4)TA克隆与重组质粒的筛选鉴定；