[发明专利]一种哈茨木霉酸性蛋白酶P6281的异源表达及纯化方法

权利要求书

1.一种哈茨木霉酸性蛋白酶 P6281 的异源表达及纯化方法，其特征在于，步骤如下：

（1）培养哈茨木霉；

（2）提取哈茨木霉总 RNA；

（3）RT-PCR 克隆 p6281 编码序列；

（4）TA 克隆与重组质粒的筛选鉴定；

（5）筛选鉴定的重组质粒转化毕赤酵母 GS115；

（6）P6281重组蛋白的发酵诱导及纯化，所述的发酵诱导的具体操作为：将阳性重组毕赤酵母转移至 BMGY 培养液，添加 1.5%的甲醇溶液进行诱导表达；

（7）P6281重组蛋白的 SDS-PAGE 检测；

步骤（3）中所述的 RT-PCR 克隆 p6281 编码序列的步骤如下：先获取哈茨木霉cDNA，然后进行 PCR 反应获得目的 DNA 片段，所使用的引物如下：正向引物 F：5’-CTGCGAATTCTCGCCGGTAAAGCCAAGT-3’和反向引物 R：5’- ACTTACGCGTAGCGGCGGTAGCAAAGC-3’；

步骤（5）中所述的筛选鉴定的重组质粒转化毕赤酵母 GS115 的步骤为：提取重组质粒，然后对重组质粒用 BglII 内切酶酶切，将重组质粒线性化；制备毕赤酵母 GS115 感受态；使用电转化法把线性化质粒转入毕赤酵母中；

所述的哈茨木霉为GIM 3.442；

在步骤（4）中所述的 TA 克隆与重组质粒的筛选鉴定的步骤如下：高保真酶产物经切胶回收后，将基因片段与 pMD18-T 载体连接，T 载体连接体系如下：pMD18-T 为 0.5μL、p6281 为 4.5μL、Solution I 为 5μL。

2.如权利要求 1所述的哈茨木霉酸性蛋白酶 P6281 的异源表达及纯化方法，其特征在于，步骤（1）中所述的培养哈茨木霉是将哈茨木霉 GIM 3.442 接种至 PDA 固体培养基中，30℃培养 2 天。

3.如权利要求 1所述的哈茨木霉酸性蛋白酶 P6281 的异源表达及纯化方法，其特征在于，在步骤（6）中所述的纯化为使用镍柱亲和层析和 Sephadex G-75 柱层析纯化目的蛋白。