[发明专利]一种携带白介素6基因的重组狂犬病病毒及其应用

权利要求书

1.一种携带犬IL6基因的重组狂犬病病毒rHEP-CaIL6，其特征在于，是以狂犬病病毒HEP-Flury株为骨架，将SEQ ID NO.1所示的犬IL6基因插入HEP-Flury，得到携带犬IL6基因的重组质粒pHEP-CaIL6，最后拯救筛选获得重组狂犬病病毒株rHEP-CaIL6。

2.根据权利要求1所述的重组狂犬病病毒rHEP-CaIL6，其特征在于，犬IL6基因被克隆至HEP-Flury的G基因和L基因之间。

3.根据权利要求1所述的重组狂犬病病毒rHEP-CaIL6，其特征在于，由如下方法构建得到：

S1.构建重组质粒pHEP-CaIL6：将SEQ ID NO.1所示犬IL6基因克隆至狂犬病病毒HEP-Flury株全长cDNA中；

S2.利用重组质粒进行拯救获得重组病毒rHEP-CaIL6。

4.根据权利要求3所述的重组狂犬病病毒rHEP-CaIL6，其特征在于，步骤S1构建重组质粒的具体方法如下：

S11.利用引物IL6-F/IL6-R扩增犬IL6基因，并引入Bsi WI和Pst I酶切位点；所述引物IL6-F/IL6- R的序列分别如SEQ ID NO.2和3所示；

S12.利用核酸限制性内切酶Bsi WI和Pst I，分别对IL6基因和pHEP-3.0质粒对进行酶切处理，两者的酶切产物连接获得重组质粒pHEP-CaIL6。

5.根据权利要求4所述的重组狂犬病病毒rHEP-CaIL6，其特征在于，步骤S12所述pHEP-3.0质粒是携带HEP-Flury毒株全长cDNA的重组质粒。

6.根据权利要求3所述的重组狂犬病病毒rHEP-CaIL6，其特征在于，步骤S2的具体方法为：

S21.转染：

S211.细胞培养板中培养BHK-21细胞；

S212.按照1：0.25：0.125：0.05：0.075的质量比，将重组质粒pHEP-CaIL6，和辅助质粒 pH-N、pH-P、pH-L、pH-G混匀，添加灭菌去离子水，添加转染试剂，漩涡震荡器上震荡，室温静置后，添加含10%胎牛血清与100IU/mL双抗的DMEM，混匀得溶解液；

S213.溶解液加入细胞37℃培养2.5~3h，靠板壁轻轻吸去DMEM，用1×PBS洗涤细胞一次，重新添加含10%胎牛血清与双抗的DMEM；在37℃ 5%CO₂培养箱中培养48h，细胞95%长满后转入34℃培养96h；

S22.病毒筛选。

7.根据权利要求6所述的重组狂犬病病毒rHEP-CaIL6，其特征在于，步骤S212中灭菌去离子水和重组质粒pHEP-CaIL6的体积质量比为75μL/µg；灭菌去离子水和转染试剂的体积比为10：1。

8.根据权利要求6所述的重组狂犬病病毒rHEP-CaIL6，其特征在于，步骤S212中含10%胎牛血清与100IU/mL双抗的DMEM和重组质粒pHEP-CaIL6体积质量比为400μL/µg。

9.根据权利要求6所述的重组狂犬病病毒rHEP-CaIL6，其特征在于，步骤S212中震荡10s，室温静置20min；

步骤S211具体是：将细胞培养板中培养至细胞密度为1×10⁵个/孔，培养液中含10%胎牛血清；37℃培养12~16h，至细胞60%~80%汇合；转染时用1×PBS洗涤细胞一次。

10.权利要求1～9任一所述重组狂犬病病毒rHEP-CaIL6在作为或制备狂犬病疫苗方面的应用。