[发明专利]一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB‑SS‑1及其培养方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及菌株领域，具体涉及一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB-SS-1及其培养方法和应用。

背景技术

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus，B.C)在土壤等环境中广泛存在，是一种需氧型的芽孢杆菌，其产生丰富的蛋白酶、SOD、淀粉酶及抑菌物质等代谢产物。微生态制剂，以蜡样芽孢杆菌为主要细菌，可以克服很多副作用，例如使用抗生素作为饲料和药品添加剂所带来的副作用，人和动物肠道微生态系统失调、免疫力下降、药物残留及产生抗药性等。B.C菌类制剂大多为非消化性药剂或食品添加剂，能选择性促进生活在肠道的微生物的活性，同时抑制肠道内有害病菌的生长，降低宿主染病的机会，使宿主保证健康。另外，B.C菌在生长过程中还会产生有益的代谢产物，刺激和促进宿主的生长。

B.C菌虽然在其作为有益菌方面已获得了长足的发展和足够的重视，但是B.C菌也是一种条件致病菌，在一定旳条件下也会对动物机体造成很强的致病性，因此它危害也应该引起我们足够的重视。研究表明，该菌同昆虫病原菌苏云金杆菌、人畜病原菌、炭疽芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、韦氏芽抱杆菌组成芽孢杆菌属蜡样芽孢杆菌组，它们的形态特征、生理生化特征非常相似并有着极高的同源性，该菌也曾被多次报道引起人食物中毒、以及在养殖过程中引发部分动物疾病等。鉴于B.C菌包含有益菌株和致病性菌株，因此在使用前应首先确定菌株是否为致病菌株，确保其安全性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB-SS-1及其培养方法和应用。

为实现上述目的，发明人从发病麋鹿群中分离到了一株新型致病性蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HB-SS-1，所述菌株于2016年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武昌珞珈山，保藏编号为：CCTCC NO：M2016672。

所述(Bacillus cereus)HB-SS-1的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了上述新型致病性蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HB-SS-1的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、培养基配制

TSA固体培养基配制：准确称取TSA粉末40g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至50-60℃时，加入过滤除菌的羊血清60mL，混合均匀后倒板备用；

TSB液体培养基配制：准确称取TSB粉末30g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，临用前加入过滤除菌的羊血清60mL即可；

S2、分离纯化

选取发病麋鹿的肺、胸水、心包液、关节液接种TSA/NAD固体培养基，置37℃、5％CO₂条件下培养24-48小时，挑取乳白色的圆形光滑小菌落涂片，革兰氏染色镜检，选取革兰氏阳性小杆状菌，再进行两次TSA/NAD固体培养基亚克隆培养。

本发明人对该菌株进行了一系列生物学特性试验如：细菌纯化培养、涂片染色镜检、生化试验、药敏试验、PCR鉴定、动物实验。试验结果证实该菌株16SrDNA序列与炭疽杆菌部分菌株序列一致，通过动物实验证明HB-SS-1有较强毒力，能够致死实验小白鼠，该毒株可作为以后防疫麋鹿细菌病的候选疫苗菌株，可用于制备蜡样芽孢杆菌病疫苗。

附图说明

图1为本发明实施例中HB-SS-1菌株培养基生长形态。

图2为本发明实施例中HB-SS-1菌株革兰氏染色镜检。

图3为本发明实施例中HB-SS-1菌株16SrDNA基因进化树。

表1生化鉴定试验结果

注：″+″表示只产酸或阳性，″-″表示阴性

表2 HB-SS-1株药敏试验结果

注：S表示敏感；I表示中度敏感；R表示耐药。

表3半数致死量测定试验结果

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

蜡样芽孢杆菌HB-SS-1株的分离纯化和鉴定。

培养基配制