[发明专利]一种乙型肝炎病毒cccDNA的数字微滴PCR检测方法及其试剂盒

说明书

本发明属生物技术领域，涉及一种检测乙型肝炎病毒共价闭合环状脱氧核糖核酸的方法以及试剂盒。本发明采用专用组织DNA提取试剂盒提取HBV DNA，并采用选择性荧光定量PCR技术对乙型肝炎病毒cccDNA进行检测，核酸提取后，采用PSAD酶处理，及采用数字微滴PCR方法扩增目的基因并直接定量，提高检测灵敏性和特异性，检测结果表明，能对HBVcccDNA进行准确定量分析，明显优于一般方法，具有特异性好，灵敏度高，定量准确，快速简便，重复性好的特点，本发明的方法及试剂盒可用于HBVcccDNA检测，也可作为临床实验室对HBV感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段。

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及检测乙型肝炎病毒的方法及试剂盒，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒共价闭合环状脱氧核糖核酸(HBVcccDNA) 的方法以及试剂盒。

背景技术

现有技术公开了乙型肝炎病毒(HBV) 属于嗜肝DNA 病毒家族，其基因组是双链松弛环状DNA(relaxed circu2lar，rcDNA)，相对分子量为(116 ～210)×109 全长约为312kb。研究表明，在HBV的生活周期中，共价闭合环状DNA(covalently closed circularDNA，cccDNA)的形成是关键一步，其是HBV 的原始复制模板，对乙肝病毒的复制及感染状态的建立具有十分重要的意义。有研究显示，cccDNA 的半衰期约为33～70 天，只要肝细胞中还存在cccDNA，乙肝病毒的复制就不会停止，即使在药物的强烈抑制下，肝细胞中的cccDNA仍然在少量复制，因此停用药物后，常可见到患者病情的反复，因此，研究人员认为，只有清除细胞核内的cccDNA，才能彻底清除乙肝患者病毒携带状态。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA) 的发现与检测方法的建立始于上世纪80 年代。最初采用DNA 电泳及Southern 杂交检测技术，发现慢性乙型肝炎患者肝组织内存在一种电泳带位置为2.0kb 左右的HBV DNA 分子，并在电镜下证实为大小约3.2kb 的超螺旋DNA 分子；20 世纪90 年代，PCR 技术开始应用于cccDNA 检测，Kock(Hepatology,1996) 等建立了选择性PCR cccDNA 检测技术；本世纪初，香港学者He(Biochem Biophys Res Commun 2002) 等建立了选择性数字微滴PCR 检测cccDNA 的技术，实现了真正意义上的定量检测。

目前cccDNA 检测技术面临的主要问题是特异性和敏感性，尚存在争议。有研究在研究过程中发现了一些引人注意的问题，如：通常国内外有关机构将实验室建立的技术用于临床标本的检测，但迄今为止，国内外尚无公认的、较稳定并得到CFDA正式批准的HBVcccDNA 检测试剂盒问世；采用相同或不同技术研究外周血单个核细胞内是否存在cccDNA，所得出结论截然相反；若干作者报告在慢性乙型肝炎的血清内检测到了高含量HBVcccDNA，个别报告甚至高达10⁷ 拷贝/ml ，结果的可信度值得探讨；越来越多的研究报告采用cccDNA 定量检测结果比较或评价抗病毒药物疗效，但是鲜有作者关注cccDNA 检测技术问题。