[发明专利]一种乙型肝炎病毒cccDNA的数字微滴PCR检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种乙型肝炎病毒cccDNA的数字微滴PCR 检测方法，其特征在于，其包括：

在按下述方法设计的引物和探针存在下，用PSAD 酶预处理乙肝病毒DNA，实现对HBVcccDNA 特异性检测：

1) 根据HBV 全序列，在HBV 基因组前C 编码区，设计并合成如下序列的引物和探针：

PCR引物F ：5’-TCCCCGTCTGTGCCTTC-3’(nt1547-nt1565)

PCR引物R ：5’-CCCCAAAGCCACCCAA-3’(nt1902-nt1887)

2) 组成乙型肝炎病毒cccDNA数字微滴PCR 诊断试剂盒；

3) 制备反应液；

4) PSAD 酶处理HBV DNA；

5) 定量检测待测样品中HBVcccDNA 的含量。

2.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤3）中，反应液每份为26μl，每份反应液中含组分：5×PCR Buffer，0.2mmol/L dNTPs，2.5mmol/LMgCl2，引物HBV-F和HBV-R 各0.2μmol/L， DNA 聚合酶1U。

3.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤4）中，在25μl 总反应体系中：依次加进1μl 25mM ATP，2.5μl10 倍的Buffer，提取的乙肝DNA 模板溶液12.5μl，和0.5μl 的质粒保护DNA 酶，再用25μl，将反应体系置于37℃环境中温育30min，70℃灭活30min。

4.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤5）中，定量检测待测样品中HBVcccDNA 的含量：PSAD 酶处理的HBVcccDNA，浓度分别为108、107、106、105、104copies/ml 的5 个标准品各4μl，各加入步骤(3) 制得的反应液26μl，分别放入各个反应管中进行处理，同时设空白管和阴性对照；各反应管进行扩增，将含待测样品反应管的扩增结果与其它反应管扩增结果比较，得出待测样品中HBVcccDNA 的含量。

5.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤5）中，所述的扩增是于伯乐微滴数字PCR仪中进行扩增：扩增时的温度条件依次为50℃下2 分钟、94℃预变性4 分钟、94℃下15 秒、60℃ 45 秒构成一个循环，共40 个循环。

6.一种乙型肝炎病毒cccDNA数字微滴PCR 检测试剂盒，其特征是：该试剂盒包括成分：如权利要求1所述的一对特异性HBV引物， Taq 酶，Plasmid-Safe ATP-dependent DNase酶，乙型肝炎病毒cccDNA阳性对照，和阴性对照和PCR Buffer。