[发明专利]一种产衣康酸的重组酵母菌株及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产衣康酸的重组酵母菌株及其构建方法与应用，属于基因工程领域。

背景技术

衣康酸是一种重要的化工产品，是美国能源部认证为的十二个重要高附加值化学品之一，主要用于生产树脂、塑料、橡胶、合成纤维、表面活性剂等。衣康酸多聚体也可以用替代原有添加剂丙烯酸。此外，有研究发现在哺乳动物免疫细胞中衣康酸可以作为一种抗菌物质起作用。

目前，衣康酸的生产菌株主要是土曲霉。在土曲霉中衣康酸的代谢途径是由TCA循环分流出来的，TCA循环中的顺乌头酸在顺乌头酸脱羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)的作用下转化成衣康酸(Dwiarti,L.,Yamane,K.,Yamatani,H.,Kahar,P.,Okabe,M.,2002.Purification and characterization of cis-aconitic acid decarboxylase from Aspergillus terreus TN484-M1.J.Biosci.Bioeng.94,29–33；Kanamasa,S.,Dwiarti,L.,Okabe,M.,Park,E.Y.,2008.Cloning and functional characterization of the cis-aconitic acid decarboxylase(CAD)gene from Aspergillus terreus.Appl.Microbiol.Biotechnol.80,223-229)，顺乌头酸脱羧酶CAD是衣康酸生物合成途径中的关键酶。然而，在衣康酸合成过程中，土曲霉生长缓慢，发酵周期长；发酵过程中需要连续曝气和高速搅拌来满足菌体生长对溶氧的需求，但高速搅拌产生的机械压力又会使得菌丝受损而影响菌体生长。土曲霉的这些缺点使得亟要寻求一种新的宿主来生产衣康酸。

产甘油假丝酵母(C.glycerolgenesis CCTCC AB 204047)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，生长速度快，能在55％葡萄糖或15％Nacl的高渗透压培养基上正常生长繁殖，具有耐高渗和高抗逆性的特点，对衣康酸有较强耐受性。

发明内容

本发明目的在于提供一种产衣康酸的重组酵母菌株及其构建方法与应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种产衣康酸的重组酵母菌株，所述菌株以C.glycerolgenesis CCTCC AB204047为出发菌株，通过基因工程改造在C.glycerolgenesis基因组中插入顺乌头酸脱羧酶表达盒Pgap-CadA-Tgap-zeocin得到的重组酵母菌株。

本发明中所述顺乌头酸脱羧酶表达盒Pgap-CadA-Tgap-zeocin包括能够在宿主细胞中表达SEQ ID NO.1所示的顺乌头酸脱羧酶的DNA，启动所述顺乌头酸脱羧酶基因转录的C.glycerolgenesis甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子，终止顺乌头酸脱羧酶基因转录的C.glycerolgenesis甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因终止子，还包括表达博来霉素的DNA，该DNA包括启动和终止所述博来霉素基因转录的启动子和终止子。

产衣康酸的重组酵母菌株的构建方法，通过基因工程构建含顺乌头酸脱羧酶表达盒Pgap-CadA-Tgap-zeocin的重组质粒，重组质粒线性化后将其插入C.glycerolgenesis基因组中得到重组酵母菌株。

产衣康酸的重组酵母菌株在制备衣康酸中的应用，将所述的重组酵母菌株培养于发酵培养基中，所述发酵培养基为：50g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，zeocin 150μg/mL，余量为水。