[发明专利]一种蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法

说明书

本发明提供了一种蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法，包括在发酵周期中流加大肠杆菌，以及固液分离去除底部大肠杆菌，取上层澄清液等步骤。本发明的培养蛭弧菌的培养基成分简单，可以在10L、100L、1000L进行规模发酵，有利于工业化放大；发酵周期短，只有一次流加操作，提高了生产效率，并降低操作难度，减少了中间操作过程可能带来的污染问题；蛭弧菌产量高同时在发酵结束时，对大肠杆菌进行固液分离，可以忽略不计蛭弧菌微生态制剂中大肠杆菌的含量，避免了潜在的环境危害。

技术领域

本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种噬菌蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法。

背景技术

目前控制、消除致病菌的主要手段仍是各种物理或化学的方法，包括各种抗生素的使用。物理或化学的方法都存在着明显的弊端。首先，物理的方法对各种致病菌的消除作用只能应用于相关领域的某一环节，不能实现整个领域所有环节的应用，其次，化学方法中的酸碱处理虽可以取得一定防治效果，但在有害菌形成生物膜后，这些方法的效果就极不理想；最后，抗生素虽然开始使用效果显著，但是长期使用，不仅会增强病原菌的抗药性，而且抑制有益菌群，最终不能有效地控制、消除致病菌。

近年来，微生物生态制剂的研究开发受到各方关注，特别是蛭弧菌的研究受到人们的青睐。蛭弧菌自1963年被发现以来，因其是一种寄生菌，能裂解大肠杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌、弧菌等革兰等革兰氏阴性致病菌且对人和动物无害，而备受关注。

专利申请号为94114314.7，名称为“噬菌蛭弧菌生态制剂的制备方法”的国家发明专利申请提出一种培养基培养在10000ml放水瓶，装液为5000ml使用大肠杆菌培养蛭弧菌5～7天，最终蛭弧菌效价为10⁵～10⁸pfu/ml。其主要缺点是生产规模太小，最大发酵量仅为5000ml，同时，培养基复杂，配制繁琐。

专利申请号为93111749.6，名称为“生物制菌王及其生产方法”的国家发明专利申请提出用高温(70～150℃)或化学药物(氯仿等)将大肠杆菌杀死，制造灭活的宿主菌，接着用其培养蛭弧菌，得到蛭弧菌制剂。然而该方法使用灭活的大肠杆菌，工序复杂，同时生产出来的蛭弧菌裂解能力也较低，同时蛭弧菌的效价未提及，同时生产出来的蛭弧菌微生态制剂未对大肠杆菌进行分离。

专利申请号200810145709.5，名称为“蛭弧菌微生态制剂的生产方法”提供了蛭弧菌微生态制剂的生产方法，主要和传统方法不同的是将宿主大肠杆菌冻干成菌粉使用，工艺复杂，成本高，同时蛭弧菌浓度不高，只有1×10⁷pfu。然而该方法使用大肠杆菌冻干粉作为营养源，工序复杂，同时，蛭弧菌的效价也不高为1×107pfu/ml，同时，未对大肠杆菌进行固液分离。

专利申请号200810202809.7，名称为“双效蛭弧菌的发酵生产方法”的国家发明专利申请提供了一种双效蛭弧菌的发酵生产方法，即先发酵制备宿主菌的混悬液，再加入宿主菌混悬液和蛭弧菌液到配制好的培养液中进行发酵。虽然该生产方法生产出的蛭弧菌含量较高(5×10⁸pfu/ml)，但其宿主菌选用了致病性的嗜水气单胞菌，而且发酵时间较长(72～120h)，会导致生产成本的增加。另外，此技术也可能存在着所得的蛭弧菌裂解活性不高的问题。

专利申请号201010270772.9，名称为“一种蛭弧菌制剂及其发酵方法和应用”提供了一种使用革兰氏阳性菌(不含大肠杆菌)发酵生产蛭弧菌的方法，通过发酵过程中多次添加宿主菌株，最终发酵浓度为10⁸～10¹²pfu/ml，发酵周期为36～48h。该方法主要缺点是在发酵过程中多次添加宿主菌，操作要求高，工序复杂，容易染菌，同时发酵周期较长(36～48h)，产量不高10⁸～10¹²pfu/ml。

发明内容

有鉴于此，本发明的第一目的在于提供一种蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法，包括以下步骤：