[发明专利]DNA聚合酶链置换活性检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种DNA聚合酶链置换活性检测方法，包括：制备扩增反应体系并进行扩增反应，得扩增产物；所述扩增反应体系包括扩增模板链，扩增引物，待测DNA聚合酶，dNTP以及扩增缓冲液；所述扩增模板链从3’至5’端依次包括第一单链区、茎环结构区和第二单链区；所述茎环结构区从3’至5’方向依次包括第一配对区、单链环区和第二配对区，所述第一配对区和第二配对区完全互补配对；所述第二单链区上含有限制性内切酶酶切位点；所述扩增引物结合在第一单链区上；采用相应的限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到酶切产物；对酶切产物进行凝胶电泳测试，根据检测结果确定DNA聚合酶的链置换活性。本发明的检测方法不会造成环境污染，操作简单，检测成本低。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种DNA聚合酶链置换活性检测方法及试剂盒。

背景技术

DNA聚合酶（DNA polymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶，主要活性是催化DNA合成。在DNA复制过程中，通常需要在解旋酶协同参与下打开DNA双链螺旋结构，然后再在DNA聚合酶作用下进行DNA合成。部分具有链置换活性的DNA聚合酶具有打开DNA双链氢键的活性，从而使得当体系中不含解旋酶时，也可以同时进行DNA双链打开和合成新的DNA双链。

现有技术文献公开了采用单链环状M13噬菌体DNA检测DNA聚合酶的链置换活性，具体的是利用特异性扩增引物与单链环状M13噬菌体DNA退火，再加入DNA聚合酶进行扩增反应，如图1所示，将特异性扩增引物2锚定在单链环状M13噬菌体DNA 1上，在DNA聚合酶的作用下发生DNA合成反应。当扩增反应进行至与引物5’端时，不具备链置换活性的DNA聚合酶催化的DNA合成反应终止，形成第一扩增产物3；具备链置换活性的DNA聚合酶以链置换的方式继续合成DNA，形成的第二扩增产物4。其中第一扩增产物3和第二扩增产物4均为双链环状结构，第一扩增产物3的双链环状结构中含有特异性扩增引物序列，第二扩增产物的双链环状结构中不含有特异性扩增引物序列。采用同位素元素标记扩增反应体系中的dATP，然后对扩增产物采用碱性电泳测试，通过检测扩增产物的条带大小即可判断DNA聚合酶是否具有链置换活性。但采用同位素标记检测DNA聚合酶链置换活性的方法污染严重，对实验条件要求高、检测成本高。

因此，需要一种无污染、对实验条件要求低、检测成本低的DNA聚合酶链置换活性检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA聚合酶链置换活性检测方法及试剂盒，旨在解决现有技术中DNA聚合酶链置换活性检测对反应体系要求高、成本高的问题。

为了实现发明目的，本发明提供了一种DNA聚合酶链置换活性检测方法，包括以下步骤：

A、制备扩增反应体系并进行扩增反应，得扩增产物；所述扩增反应体系包括扩增模板链，扩增引物，待测DNA聚合酶，dNTP以及扩增缓冲液；所述扩增模板链从3’至5’端依次包括第一单链区、茎环结构区和第二单链区；所述茎环结构区从3’至5’方向依次包括第一配对区、单链环区和第二配对区，所述第一配对区和第二配对区完全互补配对；所述第二单链区上含有限制性内切酶酶切位点；所述扩增引物结合在第一单链区上；

B、采用相应的限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到酶切产物；

C、对酶切产物进行凝胶电泳测试，根据检测结果确定DNA聚合酶的链置换活性。

优选的，所述限制性内切酶酶切位点与第二单链区5’末端之间的距离至少为20bp。

优选的，所述第一单链区长度为15至20bp，所述扩增引物与第一单链区完全互补配对。

优选的，所述单链环区的长度为3至10bp。