[发明专利]一种猪肝细胞无血清培养基及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物细胞培养技术领域，尤其涉及一种猪肝细胞无血清培养基及其制备方法。

背景技术

肝脏是人与动物机体发挥储存糖原、调节代谢、去氧化、分泌活性因子和生物转化等生理功能的重要器官，也是药物代谢与解毒作用的主要场所。而肝细胞则是肝脏组织发挥上述生物学功能的主要执行者，为此众多离体试验常选用人或畜禽原代肝细胞为研究模型，展开肝细胞生理调节功能，代谢性疾病，药理学、病理学和毒理学分子机制，建立病毒感染细胞模型，以及理化因子与毒物影响等领域的研究。原代肝细胞的离体培养是实施以上体外研究的首要环节，故成功实现肝细胞体外培养显得至关重要。

目前，原代肝细胞的离体培养常采用血清培养基，借助外源血清提供细胞增殖分化所需的生长因子、激素、转运蛋白及部分营养素等，以维持细胞正常的生长与分裂增殖，获取其良好的生长状态与分泌特性。但使用血清培养离体细胞，同时存在诸多不足，如血清成分复杂，所携带的未知物质及其可变因素，往往影响研究结果的准确性与重现性；血清存在种属特性，异种应用容易引发不良的过敏反应与排斥性疾病等；血清还存在感染外源病毒和致病因子的巨大风险，容易导致感染转移与交叉污染，不利于动物试验或临床研究结果的正确性。可见，寻找一种既能适合细胞正常生长，又能避免因添加外源血清干扰研究结果的猪用离体肝细胞培养基显得尤为重要，以便实现猪肝细胞的无血清培养。据报道，美国、欧盟与日本等发达国家已于2010年全面停止血清在生物制药中的应用，美国FDA也将停止受理以含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药及其相关医疗技术的申报，使得无血清细胞培养成为生命科学研究的新趋势。

目前，国内外均无正式生产猪源性肝细胞无血清培养基的厂家。近年来，美国Invitrogen公司已推出HepatoZYME-SFM无血清培养基，但有文献指出使用HepatoZYME-SFM无血清培养基进行原代大鼠肝细胞培养时，仍需加入了10％胎牛血清。此外，还有研究者采用其它无血清培养基进行相关研究，但是这几种无血清培养基含有动物来源成分，且不能用于猪原代肝细胞悬浮培养，难以满足科研和临床应用的需求。其他商品化的肝细胞无血清培养基却存在培养基的成分配方秘而不宣、价格昂贵与配制方法不确定等多方面问题，难以在肝细胞离体无血清培养研究领域推广应用。国内虽有一些专利申请公开一些无血清肝细胞培养基，所开发的无血清肝细胞培养基均可适用于生物人工肝支持系统，但难以用于或适用于猪肝细胞无血清的培养，更无法满足后者的相关研究和应用，故亟需研制一种新的猪肝细胞无血清培养基。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺点和不足，提供一种猪肝细胞无血清培养基及其制备方法，所述培养基能够用于猪原代肝细胞的培养。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种猪肝细胞无血清培养基，其在基础培养液中添加有如下组分：牛胰岛素10.00mg/L，人转铁蛋白5.50mg/L，亚硒酸钠5.02μg/L，乙醇胺2.00mg/L，地塞米松196.26μg/L，纤粘连蛋白0.5mg/L，维生素C 10.00mg/L，肝细胞生长因子60.00μg/L，表皮生长因子80.00μg/L，胰高血糖素2.00mg/L和牛血清白蛋白1.50g/L。

相对于现有技术，本发明的猪肝细胞无血清培养基，能够用于猪原代肝细胞的培养，能够促进培养的细胞贴壁，并保持良好的生长状态，猪原代肝细胞经培养后形态、活力与含血清培养后的十分相当，且其生长状况明显良好，能很好地保持猪肝细胞原有的生物特性与生物学功能，还能避免因传统含血清培养基所带来的负面影响，能够满足肝细胞正常生长与分裂增殖的条件需求。

进一步，所述基础培养液为Williams’Medium E基础培养液，更优选为含有青霉素和链霉素的Williams’Medium E基础培养液。该基础培养液能够有效抑制细菌生长，避免细胞被污染。

本发明所述的猪肝细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：

S1：于无菌环境中，按所述各组分的含量配制各组分的母液；

S2：将各组分的母液按比例加入基础培养液中，充分混匀，即得到所述的猪肝细胞无血清培养。

相对于现有技术，本发明的猪肝细胞无血清培养基的制备方法，先配制各组分的母液，然后依次加入到基础培养液中，能够使各种添加组分充分混匀在基础培养液中，使得到的无血清培养基均匀稳定，能够促进培养的细胞贴壁，并保持良好的生长状态。

进一步，步骤S1中，各组分的母液的配制方法如下：