[发明专利]一种免疫缺陷大鼠模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于大鼠模型构建领域，具体涉及一种免疫缺陷大鼠模型的构建方法。

背景技术

动物模型主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学(包括新药筛选)研究。人类疾病的发展十分复杂，以人本身作为实验对象来深入探讨疾病发生机制，推动医药学的发展来之缓慢，临床积累的经验不仅在时间和空间上都存在局限性，而且许多实验在道义上和方法上也受到限制。而借助于动物模型的间接研究，可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，有助于更方便、更有效地研究人类疾病的发生发展规律，研究防治措施。免疫缺陷动物模型可用于药物开发、移植研究以及人类疾病的治疗机理研究。目前，常用的免疫缺陷动物模型多为小鼠，而大鼠与人类的同源性更接近，所以使用大鼠模型比小鼠模型研究人类相关疾病具有明显的优势。衡量机体免疫缺陷的程度，主要测量机体内T、B淋巴细胞和NK细胞所占的比例。日本学者Tomoji等人(Mashimo T,Takizawa A,et al:Generation and characterization of severe combined immunodeficiency rats.Cell reports 2012,2:685-694.、Mashimo T,Takizawa A,et al:Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency(X-SCID)using zinc-finger nucleases.PloS one 2010,5:e8870.)用Zinc-Finger技术得到IL2Rγ和Prkdc基因敲除的大鼠，并证实IL2Rγ纯合敲除大鼠外周血、骨髓和脾脏中T细胞明显减少，B细胞和NK细胞在外周血和骨髓中消失，仅在脾脏中有一些残留； Prkdc基因敲除的大鼠CD4^-CD8⁺、CD4⁺CD8^-和CD4⁺CD8⁺T细胞全部消失，B细胞也明显消失，而NK细胞数量增加；两个基因同时敲除的大鼠，T、B淋巴细胞和NK细胞全部消失。但是，发明人发现现有技术中的免疫缺陷大鼠模型至少存在如下的问题：在Prkdc和IL2Rγ同时敲除的大鼠模型上移植人的CD34+造血干细胞，却并没有产生人的免疫系统细胞。

因此，现有的免疫缺陷动物模型还不能满足药物试验和异种细胞移植研究等的需求，这是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种新的免疫缺陷大鼠模型，填补了免疫缺陷大鼠模型品系空缺，能够符合试验需求。

第一方面，提供了一种免疫缺陷大鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)将针对大鼠DNA的Prkdc和IL2Rγ基因敲除的gRNA分别进行体外转录，再分别与体外转录的CAS9蛋白mRNA混合，冻存于无RNA酶的超纯水中，得到相应的注射液A及注射液B；

(2)将人SIRPa基因组DNA扩增，纯化，冻存于无RNA酶的超纯水中，得到注射液C；

(3)采用显微注射法将注射液A和注射液B分别注射进不同的大鼠受精卵的胞质中，然后将大鼠受精卵分别移植入不同假孕雌鼠体内，培育得到第二代大鼠A和第二代大鼠B；

(4)采用显微注射法将注射液C注射进大鼠受精卵的原核中，然后将大鼠受精卵移植入假孕雌鼠体内，培育得到第二代大鼠C；

(5)将第二代大鼠A、第二代大鼠B和第二代大鼠C进行杂交，繁殖F1代；再将F1代进行杂交，得到敲除了IL2Rγ和Prkdc基因并转入了人SIRPa基因的免疫缺陷大鼠模型。

结合第一方面，在第一方面的一种可能的实现方式中，步骤(1)中的敲除大鼠Prkdc基因采用两条gRNA序列，分别为：第一外显子gRNA序 列1：TTCCGGCACTATGGCGGACC；第一外显子gRNA序列2：GCCAGTTACCAGCTGATCCG。

结合第一方面或上述某些可能的实施方式，在第一方面的一种可能的实现方式中，步骤(1)中的敲除大鼠IL2Rγ基因采用两条gRNA序列，分别为：第二外显子gRNA序列1：CAGCCGACCAACCTCACTAT；第四外显子gRNA序列2：GAGTGAATCTCAGGTAGAAC。