[发明专利]一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法

说明书

本发明公开了一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，以铜绿假单胞菌特有的ETA保守序列为靶基因序列，设计一套LAMP特异性引物，对纺织品样品增菌后产物进行LAMP扩增，扩增后的产物形成白色沉淀，通过对比观察可判定结果，或通过浊度仪观察结果，样品反应浊度值小于0.1时，可判定该样品结果为阴性，样品反应浊度值大于或等于0.1时，可判定该样品结果为阳性。对判定为阳性样品增菌液接种平板分离，挑取平板上典型或可疑菌落，利用MALDI‑TOF‑MS技术鉴定快速鉴定出结果。本方法操作简单，快速、高效、特异性强，灵敏度高，结果观察方便、直观。

技术领域

本发明涉及一种铜绿假单胞菌的检测方法，具体涉及一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法。

背景技术

铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)原称绿脓杆菌，是一种高致死率、溶血性、抗药性强的革兰氏阴性杆菌，在分类上属假单胞菌科中的假单胞菌属，此菌属种类多达200种以上，在自然界分布广泛，是土壤中存在的最常见的细菌之一。本菌最主要的生长条件是潮湿环境，其它条件要求不高。纺织品极易吸潮，具备铜绿假单胞菌生长的所有因素，能够提供其繁殖的理想环境，包括合适的pH，温度及水营养，也能提供其繁殖所需的大表面积。因此纺织品中一旦污染铜绿假单胞菌，该菌会顽强地吸附在纤维上，一般的清洗、曝晒是消灭不了的。

铜绿假单胞菌可暂时寄生于皮肤，因此接触性体表感染率相当高，能引起人中耳炎、角膜炎、尿道炎和下呼吸道感染，亦可引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸，甚至通过血流导致败血症，可引起病人死亡。

铜绿假单胞菌检测有多种方法，常见的主要有传统标准方法、全自动微生物分析系统分析法、分子生物学方法(常规PCR法、多重PCR法、PCR-DHPLC法、Real-time PCR法、基因芯片技术)、免疫学方法(免疫磁性分离法、荧光激活细胞分离法、酶联免疫吸附法)、蛋白多肽检测方法等。传统检测方法程序繁琐、周期长、灵敏度低。免疫学方法制备抗体较困难、不能同时检测多种成分，对实验人员技巧性要求高，易出现交叉污染。分子生物学方法具有高灵敏度、准确、快速等优点，但需要专门仪器设备，易污染，对检验人员要求较高。目前纺织品领域铜绿假单胞菌的检测都采用的传统培养法定性检测，在方法检测程序上也都大致相同，增菌→分离→镜检和其它验证试验，需要4d～6d。

铜绿假单胞菌是条件致病菌，在环境中广泛存在多种变体。铜绿假单胞菌可产生许多致病因子或毒力因子，包括弹性酶、碱性蛋白酶、LasA蛋白酶、溶血素、绿脓素，绿脓素是铜绿假单胞菌分泌的重要毒力因子之一。铜绿假单胞菌附着生长状态产绿脓素远远高于浮游生长状态下产绿脓素量，常常浮游生长状态下绿脓素产生不明显，因此对样品一次增菌后，仅凭是否产生绿脓素来判定铜绿假单胞菌是否生长不够严谨，不能快速得出结果，对一次增菌液进行DNA提取，初步筛选更科学合理些。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，达到 了高效、准确、省时省力的效果。具体技术方案如下：

一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤：

步骤一：样品增菌

用无菌的方式取样、增菌培养，得增菌液；

步骤二：LAMP试验

2.1)DNA模板的制备：取增菌液放入灭菌Eppendorf管内，高速冷冻离心机离心处理，除去杂质，获得DNA模板；

2.2)LAMP扩增反应

2.2.1)扩增准备：根据样本数量设定所需要的LAMP反应管数n(n＝1管空白对照+1管阴性对照+1管阳性对照+样本数)，取出n个LAMP反应管。扩增反应体系见表1，按表1计算好各试剂的使用量，按表1的顺序加入灭菌离心管中，混合混匀，2000r/min离心10sec，向设定的n个LAMP反应管中分别加入23μL；

表1 反应体系