[发明专利]一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法

权利要求书

1.一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤：

步骤一：样品增菌

用无菌的方式取样、增菌培养，得增菌液；

步骤二：LAMP试验

2.1)DNA模板的制备：取增菌液放入灭菌Eppendorf管内，高速冷冻离心机离心处理，除去杂质，获得DNA模板；

2.2)LAMP扩增反应

2.2.1)扩增准备：根据样本数量设定所需要的LAMP反应管数n(n＝1管空白对照+1管阴性对照+1管阳性对照+样本数)，取出n个LAMP反应管；扩增反应体系见表1，按表1计算好各试剂的使用量，按表1的顺序加入灭菌离心管中，混匀，2000r/min离心10sec，向设定的n个LAMP反应管中分别加入23μL；

表1反应体系

2.2.2)设定空白对照、阴性对照、阳性对照

每次反应均设置阴性对照、空白对照和阳性对照；

空白对照：以水代替DNA模板；

阴性对照：以水代替样品，按步骤2.1)提取模板DNA作为LAMP反应的模板；

阳性对照：铜绿假单胞菌标准菌株增菌后按2.1)提取模板DNA作为LAMP反应的模板；

2.2.3)加样

将步骤2.1)制备好的DNA模板、步骤2.2.2)中的空白对照、阴性对照、阳性对照各取2μL加入相应的反应管中，使反应体系达到25μL；盖紧管盖，混匀，2000r/min离心10sec；

2.2.4)上机反应

将步骤2.2.3)离心后的反应管置于水浴锅或LAMP实时浊度仪中，63℃扩增40min；

2.2.5)初步观察结果

2.2.5.1)可视化观察结果

反应结束后取出反应管，将反应管置于黑色背景下观察；先观察对照反应管，有白色沉淀者为阳性，无白色沉淀者为阴性；如果结果为阴性，可直接报告样品中未检出铜绿假单胞菌，如结果为阳性或可疑，继续进行步骤三的鉴定；

2.2.5.2)浊度仪结果

反应结束后，观察LAMP实时浊度仪生成的扩增曲线，空白对照、阴性对照无扩增曲线，反应浊度值小于0.1，阳性对照有典型扩增曲线且反应浊度值大于0.1，否则实验视为无效；样品反应浊度值小于0.1时，可判定该样品结果为阴性；样品反应浊度值大于或等于0.1时，可判定该样品结果为阳性；

步骤三：MALDI-TOF-MS技术鉴定

3.1)分离

取步骤2.2.5)初步观察结果为阳性的样品的增菌培养液，用一次性接种环，从培养液的薄菌膜下方挑取培养物，划线接种在一个假单胞菌CN选择性培养基平板上，置36℃±1℃培养24h±2h；铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素；挑取2个或2个以上假单胞菌CN选择性培养基平板上典型或可疑菌落，通过MALDI-TOF-MS技术鉴定可疑菌落指纹谱图，利用MALDI Biotyper System分析对比得出最终鉴定结果；

3.2)MALDI-TOF-MS技术鉴定确认

3.2.1)配制标准品和基质

配置标准品和基质的标准溶剂为50％乙腈+47.5％水+2.5％三氟乙酸；

标准品配制：取出MALDI Biotyper System专用的标准品(Bacterial Test Standard，BTS)，加入标准溶剂50μL；使用移液器反复吹吸的方式，溶解BTS粉末；室温放置5min之后重复吹吸，13000r/min离心2min，备用；

基质配制：取出MALDI Biotyper System专用的基质HCCAportioned，加入250μL标准溶剂，振荡混匀，直到形成澄清溶液；

3.2.2)MALDI BioTyper自动鉴定

挑取假单胞菌CN选择性培养基平板上单个菌落均匀涂抹于靶板靶孔内，加1μLHCCA基质溶液覆盖上述样品点，室温下晾干；将靶板放入MALDI BioTyper自动鉴定仪，MALDIBiotyper System分析过程中同时采集样品质谱图，由FlexControl3.0得到蛋白峰信息，自动鉴定结果；

步骤四：结果报告

根据步骤二试验，初步判定样品中铜绿假单胞菌检测结果；初步结果为阴性，可直接报告样品中未检出铜绿假单胞菌，如初步结果为阳性或可疑，按步骤三进行确认，报告样品中检出或未检出铜绿假单胞菌；

其中，步骤2.2.1)扩增准备中所述的引物的核苷酸序列为：

外引物F3：5'-TCTTCGGGCAGCTCCG-3'

外引物B3：5'-TGGAGGTTGGCCGAACTC-3'

内引物FIP：5'-GCACATCCCGTGGTGCGTG-CAGCGGCGTGGGAGTT-3'

内引物BIP：5'-TGGAACGGGGTGGCTTGG-ATAGCGCCCCGAAACCG-3'

环引物LoopF：5'-CAAGTGCCCGTATTGCGAC-3'

环引物LoopB：5'-ACGGCGGGGCGGGGTGGAG-3'。