[发明专利]microRNA重编程体细胞为神经干细胞的制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法及其应用。具体地，本发明涉及采用microRNA‑302、丙戊酸、polybrene、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子等组合，在正常生理环境下诱导人成纤维细胞、上皮细胞、血细胞、脂肪细胞等体细胞通过重编程技术诱导形成具有高产同时又具有良好多能性以及传代稳定性的神经干细胞。本发明方法采用单个microRNA转染体细胞，无需引入外源转录因子，制备形成克隆时间远远短于现有技术，有望开发成为治疗退行性神经系统疾病(包括脊髓损伤等病变)的治疗方法或药物，因此具有良好的临床应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术和神经发育领域，具体地，本发明涉及一种直接重编程诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法及其应用。

背景技术

随着社会老龄化程度的增加，各种神经退行性疾病的人群发病率居高不下且有上升趋势，神经系统退行性疾病以及神经系统损伤(如中风，脑缺血，脊髓损伤等)严重地威胁着人类的身体健康。帕金森病、阿尔茨海默病、脑中风等疾病均存在由于分化成熟的神经细胞不能分裂增殖以弥补损伤或死亡的细胞所造成的神经细胞丢失和功能障碍。神经系统的疾病及损伤的病理表现大都涉及到神经细胞的丢失和再生的缺陷。多种神经退行性疾病的传统内外科治疗，只能缓解症状而不能阻止疾病的进一步发展。如果损失的神经细胞得不到新生细胞的补充和修复，疾病治疗恢复的可能性将非常微小。

由于成体的神经系统再生困难，因此，神经损伤性疾病的治疗一直是困扰医学界的难题。近年来细胞替代治疗的发展，为神经系统病变的治疗带来了希望。神经干细胞在神经生物学研究和神经系统疾病细胞治疗中具有广阔的应用前景。神经干细胞不仅可以自我更新和扩增，还可以分化形成多种神经元和神经胶质细胞，用于补充和替代损伤或丢失的神经。但长期以来，神经干细胞的来源局限于流产胎儿的分离提取或胚胎干细胞/多能干细胞的定向分化。由于受到伦理和诱导效率低下等问题，严重限制了其进一步的应用。

现在存在一种直接转分化的技术，不必经过IPS阶段，可直接将分化细胞转分化形成希望的成熟细胞类型。相对于iPS，直接转分化技术降低了体外操作的复杂性，相当程度上规避了倒退回多潜能状态所需要的步骤带来的风险，如成瘤性。但只能在特定谱系细胞间进行转换，且效率低下；成熟细胞扩增能力有限，难以获得足够临床所需的细胞数量，影响了这项技术的临床应用价值。直接转分化技术不是一个具有普适性的平台，与iPS和直接转分化不同，间接谱系转换是用部分重编程技术将成熟细胞短推回至一种可塑性的中间状态，随后再进行分化。相对于iPS细胞技术，间接谱系转换缩短或绕过重编程至多能性的完整过程，提供了一种简单高效技术，体外过程从原来的将近两个月缩短至两三个星期。目前，利用不同转录因子组合诱导体细胞转分化为神经干细胞的间接谱系方法也日渐完善。但是现有的间接谱系转分化方法涉及到外源转录因子的介入，有可能发生基因插入错误导致突变，也有可能出现畸胎瘤的风险，具有一定的临床安全隐患。而且转分化时间也相对较长，无法及时应用于临床。

因此，本领域迫切需要开发一种不需要外源转录因子介入的诱导体细胞转分化为神经干细胞的方法，解决安全性和定向分化效率低下的问题，同时作为一个新的移植神经细胞来源，具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种利用重编程技术制备哺乳动物和人神经干细胞的方法。

本发明第一方面，提供了一种microRNA组合物，所述的microRNA组合物，包括mir-302、丙戊酸（VPA）、polybrene和维生素C（VC），其中microRNA所含载体为慢病毒、腺病毒、质粒等的药学上可接受的载体，以及mimics。

本发明第二方面，提供了一种microRNA组合物，所述的microRNA组合物以mir-302为主的，其它任意一个、两个或三个组分组合构成，如

(a) mir-302 ；

(b) mir-302和VPA ；

(c) mir-302、VPA和polybrene；