[发明专利]一种发酵生产单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法和应用

说明书

本发明公开了一种发酵生产单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明以甘草酸为碳源，诱导篮状真菌属的真菌产生β‑葡萄糖醛酸苷酶，可以在对环境友好的前提下，大量制备单葡萄糖醛酸甘草次酸。本发明的方法工艺简单，成本低，GAMG产量达到4.05g/L,产率为88.00％，经大孔树脂纯化后，其纯度达到80％以上，产物纯度高，不发生结构异化，并具有生产周期短、易于操作、能耗低等优点，适合与于后期的工业化生产的特点。

技术领域

本发明涉及一种发酵生产单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法和应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

甘草为豆科甘草属植物，是传统的中草药，其药用部位为干燥的根及根茎。三萜类化合物甘草酸是甘草中的主要药效成分，是目前甘草方向的研究重点，国内外学者对其的深入研究表明，甘草酸(Glycyrrhizin,GL)具有一定的抗炎、保肝、抗病毒、抗过敏、降脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、解毒等方面的作用。

单葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide,GAMG)，由一分子葡萄糖醛酸和一分子的甘草次酸通过糖苷键连接而成。其化学式为C₃₆H₅₄O₁₀，分子量为648.8g mol^-1，根据其H的平面的不同，包括18β-GAMG和18α-GAMG两种同分异构体。GAMG只含有一个葡萄糖醛酸基，其极性介于甘草酸和甘草次酸之间，能顺利进入细胞，并且亲脂性不太强，在机体内的溶解度和跨膜转运能力比甘草酸和甘草次酸强。因而有更好的生物利用度，也能比甘草酸和甘草次酸更好的发挥药效。单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG)作为甘草酸的衍生物，两者具有相似的生物活性，其在抗肝炎、抗过敏、抗癌症、抗病毒方面的疗效显著高于GL。因此，开发GAMG作为抗肝炎类、抗过敏、抗癌症方面的高效新药具有广阔的开发应用前景。GAMG的LD₅₀＝5000mg/kg，GL的LD₅₀＝805mg/kg，因此其比甘草酸更安全，GAMG作为一种新型的天然甜味剂，甜度约是甘草酸的5倍，在食品添加剂方面的应用前景广阔。在化妆品方面，GAMG的性质较为稳定，不仅耐高温、耐酸和耐压，而且有较好的乳化性和起泡性。

在现有的技术中，制备GAMG包括化学法和微生物法。甘草酸为苷元甘草次酸分别通过β-1,2糖苷键和β-1,3糖苷键和两个分子葡萄糖醛酸连接而成的，这两个糖苷键的键能是相似的，化学水解法对这两个糖苷键的选择性很低，采用高能耗和高污染的化学法制备该产物GAMG时，也会生成大量的副产物甘草次酸。因此，化学法制备生产GAMG的研究较为困难和少见。微生物制备单葡萄糖醛酸甘草次酸，其实质是微生物通过产生的β-葡萄糖醛酸苷酶将甘草酸为底物，选择性断裂两个糖基之间的β-1,2糖苷键，从而制得单葡萄糖醛酸甘草次酸。微生物发酵法存在目的产物产量低，副产物多的缺陷，使发酵不能满足国内的工业化生产需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，是将篮状真菌(Talaromyces sp)按体积以5～10％的接种量接种至以甘草酸作为碳源和诱导剂、硝酸钠为氮源的发酵培养基中，控制初始pH 4.5～6.5，于25～37℃发酵120-144h。

在本发明的一种实施方式中，所述硝酸钠浓度为2-4g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述硝酸钠浓度为3g/L。

在本发明的一种实施方式中，控制发酵过程中甘草酸浓度为1-8g/L进行诱导。

在本发明的一种实施方式中，所述甘草酸浓度为5g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述接种是接种种子液，所述种子液是将篮状真菌接种至种子培养基中，于25～40℃培养36-48h。

在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基每L含有：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.4g。