[发明专利]甲基化DNA检测方法

说明书

本申请公开了一种检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法，所述方法包括用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的DNA片段，并且获得单链DNA片段；在所述单链DNA片段一端或两端加上接头；可选地环化所述加上接头的单链DNA片段；将所述加上接头的单链DNA片段制备为包含所述特定基因组位置的DNA测序文库；对所述DNA测序文库进行测序以鉴定所述单链DNA片段的序列。本申请还公开了检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的试剂盒，以及单链连接试剂在制备检测DNA片段的特定基因组位置的甲基化的试剂盒中的用途。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年2月3日提交的中国专利申请第201610077986.1的优先权，该申请的全部内容被通过引用方式并入本申请。

技术领域

本发明涉及检测特定基因组位置的DNA甲基化的方法。

背景技术

在真核生物的DNA中，部分胞嘧啶会发生甲基化，从而产生甲基化的DNA。研究表明，DNA的甲基化可能对DNA的功能有重大影响，特别是DNA甲基化可能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。例如，基因启动子序列的甲基化一般会抑制该基因的表达。在一些研究中发现，DNA甲基化对生物的正常发育是必需的。在另一些研究中发现，DNA甲基化同基因印记，X染色体失活，以及重复元件的抑制有关。特别的，一些研究中发现，DNA甲基化和肿瘤产生相关。

基因的启动子区或末端通常会存在一些富含“CG”核苷酸对(其中G紧随C后，两个核苷酸之间通过磷酸酯键相连，因此称为“CpG”)的区域。在哺乳动物的DNA中，60％～90％的CpG序列被甲基化(Ehrlich等，1982，Amount and distribution of 5-methyl-cytosinein human DNA from different types of tissues or cells,Nucleic Acids Research10(8):2709-21)。当基因的表达调控区中某些区段富含CpG(CpG序列出现频率远高于平均)时，将该区段称为CpG岛。研究表明，肿瘤细胞的DNA中发现部分基因的表达调控区发生了在正常情况下非甲基化或低甲基化的CpG岛甲基化程度明显增高的情况，抑制了一些基因(例如，抑癌基因)的表达。而另一方面，肿瘤细胞的DNA中还发现有部分基因的表达调控区发生CpG岛的甲基化程度降低的情况，使这些基因(例如，致癌基因)表达异常。因此，通过研究DNA片段特定基因组位置的甲基化情况可以获取关于肿瘤的重要信息。

肿瘤细胞在人体内会因为细胞凋亡、免疫反应等原因释放其基因组DNA至血液中。正常组织也会将正常的基因组DNA释放至血液中。这些血浆中存在的DNA统称为细胞外游离DNA(Cell-free DNA,cfDNA)，而其中的来自肿瘤细胞的部分则被称为循环肿瘤DNA(Circulating Tumor DNA,ctDNA)。检测ctDNA中的甲基化DNA对肿瘤的早期诊断很有帮助。但是，由于ctDNA在cfDNA中的丰度极低，这要求检测ctDNA中甲基化DNA的方法有极高的灵敏度。因此，需要一种具有高灵敏度和准确性的检测DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法。

发明内容

本发明的一个方面提供了一种检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法。在一些实施方式中，该方法包括以下步骤：用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的DNA片段，所述亚硫酸氢钠处理能够使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，并且获得单链DNA片段；在所述单链DNA片段的一端或两端加上接头；使用索引引物对所述加上接头的单链DNA片段进行扩增以制备包含所述特定基因组位置的DNA测序文库；对所述DNA测序文库进行测序以鉴定所述单链DNA片段的序列。