[发明专利]甲基化DNA检测方法

权利要求书

1.一种用于非疾病诊断目的的检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法，其包括以下步骤：

用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的DNA片段，所述亚硫酸氢钠处理能够使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，并且获得单链DNA片段；

在所述单链DNA片段的两端加上接头；

在制备DNA测序文库之前，环化所述加上接头的单链DNA片段；

使用索引引物对所述加上接头的单链DNA片段进行扩增以制备包含所述特定基因组位置的DNA测序文库；

对所述DNA测序文库进行测序以鉴定所述单链DNA片段的序列，其中在亚硫酸氢钠处理中包括碱处理步骤，从而使得初始DNA变性为单链DNA；

其中通过单链DNA连接酶在所述单链DNA片段3'端加上第一接头，线性扩增所述3'端加上接头的单链DNA片段，并且通过单链DNA连接酶在所述3'端加上第一接头的单链DNA片段的扩增产物的3'端加上第二接头；

其中所述接头包括DNA分子标签，所述分子标签带有4-20个碱基用于标记原始的DNA分子；

其中所述索引引物指单一引物或者成对引物，其分别包含部分或全部与第一接头序列、第二接头序列互补的序列。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括对经亚硫酸氢钠处理过的所述DNA片段进行变性处理。

3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在经亚硫酸氢钠处理前使用第二类限制性内切酶处理DNA片段。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二类限制性内切酶选自下组：HpaII/MspI、SmaI/XmaI、BamHI、HpaII。

5.根据权利要求1所述的方法，其中使用高效环化试剂环化所述加上接头的单链DNA片段，其中所述高效环化试剂为单链DNA环化酶。

6.根据权利要求1所述的方法，其中在将所述单链DNA片段环化前，对所述DNA片段的5'末端进行磷酸化处理和对3'末端进行去磷酸化处理。

7.根据权利要求1所述的方法，其中在亚硫酸氢钠处理前对所述DNA片段进行切割处理，使得切割得到的DNA片段大小为0.01-5kb，并且所述切割得到的DNA片段包含所述特定基因组位置。

8.根据权利要求7所述的方法，其中在亚硫酸氢钠处理前对所述DNA片段进行切割处理，使得切割得到的DNA片段大小为0.1-1kb。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增的步骤使用反向PCR扩增。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增的步骤使用滚环扩增。

11.根据权利要求1所述的方法，所述测序步骤使用高通量DNA测序技术测定包含所述特定基因组位置的所述DNA测序文库的DNA序列。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述制备DNA测序文库的步骤进一步包括：在扩增步骤后使用寡核苷酸探针富集特定扩增产物。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品中的DNA包含细胞外的游离DNA。