[发明专利]生产生物活性HIV‑1TAT蛋白的方法

说明书

本申请是PCT申请号为PCT/EP2009/001198，中国国家阶段申请号为200980111208.8的发明专利申请的分案申请。原申请的发明名称为“生产生物活性HIV-1 TAT蛋白的方法”，申请日期为2009年2月6日。

本发明涉用于疫苗的生物活性HIV-1 Tat、其衍生物和其前体，包括所有HIV-1分化体-特异性形式的生产。

人免疫缺陷病毒(HIV)，即，AIDS的病原体，持续在世界范围内快速传播。WHO和UNAIDS估计自开始流行以来，已有超过六千万人感染了该病毒。在2004年年末，有超过四千万人，大部分生活在发展中国家，感染了HIV。发展中国家中HIV流行病的无情传播和由AIDS导致的发病率和死亡率加强对针对AIDS的有效、安全且廉价的疫苗的急需性。

在过去的15-20年中，HIV疫苗开发中的大部分努力集中在通过利用产生能够防止感染的中和抗体(NA)的基本原理，靶向负责病毒结合和进入的HIV包膜蛋白(Env)而获得消除性免疫(Wahren，2002)。然而，来自临床前和临床试验的结果，包括最初的III期试验(VaxGen的AIDSVAX)，其中在白种人中没有观察到对原发性感染的保护作用，这些结果是非常令人失望的。这可以通过所述疫苗不能激发保护性NA来解释，其归因于Env的高可变性(Myers，1995)，并且阻止NA对相关的、主要是构象表位的识别；且还可以通过gp120的严重糖基化来解释，其有助于隐藏关键的(中和)env-表位(在Burton 1997中综述)。

最近以来，已经开发了其它方法，其目的是诱导针对其它HIV抗原的T细胞介导的反应。这些方法目的在于控制病毒复制，其在不存在消除性免疫的条件下实现，提供保护以避免疾病进展，并因此减少病毒传播至健康个体。然而，这些方法也都失败了。其中的一个实例是Merck最近基于三种HIV基因进行的试验。这种疫苗使用三种成分的混合物产生，每种成分用一种常见的感冒病毒，即5型腺病毒(Ad5)的复制缺陷型版本制成，所述5型腺病毒(Ad5)作用为HIV gag、pol和nef基因的载体或递送载体。该疫苗不能预防感染：在接受三剂量疫苗系列中的至少一剂量的志愿者中，在接受疫苗的741名志愿者中观察到24例HIV感染，在安慰剂组的762名参与者中观察到21例HIV感染。另外，该疫苗不减少被感染的那些人血流中的病毒的量；诊断感染后约8-12周的HIV RNA水平在疫苗和安慰剂组中相似。

一种根本不同的方法是基于关键的HIV调控基因tat以及其蛋白产物tat作为疫苗候选物。作为非常早期的调控蛋白并且在HIV-1复制和发病机理中起着主要作用，Tat代表疫苗开发的最佳候选物(Ensoli，1990，1993和1994；Chang，1997)。Tat是一种在感染后非常早，甚至在HIV整合之前产生的重要的病毒调控蛋白，并且是病毒基因表达(Arya，1985；Fisher，1986；Ensoli，1993；Wu，2001)、以及细胞-到-细胞病毒传播和疾病进展所必需的。事实上，在不存在Tat时，没有或可以忽略量的结构蛋白得到表达，并且因此，不形成传染性病毒。此外，Tat由被感染的T淋巴细胞释放在细胞外环境中(Ensoli，1990和1993；Chang，1997)，并且进入感染的细胞和未感染的细胞，在感染的细胞中，其促进HIV-1复制，在未感染的细胞中，其引起控制细胞周期的细胞因子和细胞基因的激活或抑制(Frankel和Pabo，1988；Ensoli，1993；Chang，1995)。这一方法的目的在于诱导中和细胞外Tat的抗体和针对病毒感染的细胞的T细胞反应。