[发明专利]一种磁性纳米材料及其制备方法和在富集分析糖基化肽段中的应用

说明书

本发明属于生物技术与纳米材料技术领域，具体为半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料及其制备方法和在富集分析糖基化肽段中的应用。本发明将半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料与糖基化肽段溶液在乙腈/水/三氟乙酸混合液中混合，在酶解仪中孵育；在外磁场作用下分离纳米材料除去上清液，用乙腈/水/三氟乙酸混合液洗涤纳米材料；再用乙腈/水/甲酸混合液洗脱材料上富集的糖基化肽段，结合质谱分析鉴定。本发明操作简单迅速，材料可重复利用成本低廉，具有较高灵敏度和较好选择性，十分适用于糖基化肽段的富集分析，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术与纳米材料技术领域，具体涉及一种磁性纳米材料及其制备方法和在糖基化肽段富集与鉴定中应用。

背景技术

蛋白质的糖基化是生命过程中最重要的翻译后修饰之一，大约有超过50%的人类蛋白质发生了糖基化修饰，在细胞信号传导、分子识别、免疫反应等生命活动中起到了重要的作用。因此，蛋白质糖基化的全面研究对于理解人类的生命过程和疾病机理非常关键。但是目前的糖蛋白研究仍然遇到许多困难。由于发生糖基化修饰的蛋白质是低丰度蛋白，而且离子化效率很低，所以极易受到丰度高、离子化效率高的非糖蛋白的干扰，使得糖蛋白质谱检测困难、灵敏度很低。因此，在进行质谱分析鉴定之前，对于样品中的糖蛋白或糖基化肽段进行预富集处理非常必要。

近年来发展了不少分离富集糖蛋白或糖肽的方法，其中亲水相互作用色谱法（HILIC）由于广泛的糖链特异性、富集条件简便温和、重现性高、质谱兼容性好而得到广泛应用。半胱胺盐酸盐具有亲水性氨基和巯基，对于糖肽有亲水相互作用，可以用于HILIC材料的修饰。磁性微球由于快速分离、良好的生物相容性等特点在蛋白质富集分离领域有广泛应用。

通过文献调研可知，目前还没有半胱胺盐酸盐直接修饰的四氧化三铁磁性纳米材料应用在糖肽的富集研究中。结合四氧化三铁磁性纳米材料快速分离的特点和半胱胺对糖肽亲水相互作用的特点，本发明首次设计合成了半胱胺盐酸盐直接修饰的四氧化三铁磁性纳米材料，应用于糖基化肽段的分离富集。首先用传统水热法合成四氧化三铁磁性纳米颗粒，再利用铁-硫相互作用在磁球表面充分修饰了亲水性的半胱胺盐酸盐，形成了亲水性磁性纳米材料，合成方法十分简便。所合成的材料对于糖基化肽段具有选择性富集作用，大大提高了糖肽的质谱检测灵敏度，对于糖基化肽段的检测限可达0.25 fmol/μL，检测绝对量达到1ng。

发明内容

本发明目的在于提供一种磁性纳米材料及其制备方法和在富集分析糖基化肽段中的应用。

本发明所提出的磁性纳米材料，是一种半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料，具有快速磁性分离能力以及优异的亲水性，制备的具体步骤如下：

（1）称取六水合氯化铁分散于乙二醇中，磁力搅拌混匀，往该混合液中加入无水醋酸钠，继续搅拌混均，超声分散0.5-1小时后，把混合液转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，180-220℃条件下反应14-16小时，随后用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥，得到四氧化三铁磁性纳米颗粒；

（2）称取步骤（1）所得四氧化三铁磁性纳米颗粒，分散到磷酸盐缓冲液中，再加入半胱胺盐酸盐，超声分散1-10分钟，30-60℃水浴下机械搅拌1-5小时，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水充分洗涤，在40-60℃下真空干燥，得到半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料。

本发明中，步骤（1）中六水合氯化铁、乙二醇和无水醋酸钠的比为（1-5）g：（50-300）mL：（2.5-15）g。

本发明中，步骤（2）中四氧化三铁磁性纳米颗粒、磷酸盐缓冲液和半胱胺盐酸盐的比为（1-50）mg：（1-120）mL：（3-200）mg。

由上述制备方法得到的半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料，具有快速磁性分离能力以及优异的亲水性，可用于富集分析糖基化肽段，具体步骤为：