[发明专利]质粒提取试剂盒及提取质粒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种质粒提取试剂盒及提取质粒的方法。

背景技术

碱裂法提取质粒最早由Birnboin和Doly于1979年提出，能有效去除染色体DNA以及回收质粒DNA，但是菌液的量一般不会太多，否则会导致过多的蛋白残留而使裂解不完全，或者会导致蛋白与质粒共沉淀无法回收到足够的质粒。一般国际上的试剂公司，采用有滤芯的回收柱来回收质粒DNA，但是由于碱裂法的要求和限制，难以对更大容量的DNA进行有效的回收。目前市面上各种试剂盒一般会加入聚乙二醇、triton和MOPS等易造成水体污染的有机试剂。

因此，亟待开发一种既能够提高质粒提取的量，又绿色、环保和高效的质粒提取方法及相关试剂盒产品。

发明内容

本发明旨在提高质粒提取的量来满足大多数实验室的科研需要，并且改进实验技术减少对环境的污染，使质粒提取实验方法和试剂盒绿色、环保和高效，提供一种基于碱裂法开发的质粒提取试剂盒及提取质粒的方法。

为了实现本发明目的，本发明的质粒提取试剂盒，包括溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5和絮凝粉；所述溶液1为双蒸水，所述溶液2为0.21M的NaOH溶液，所述溶液3为含有1.6～2.0M乙酸钾(优选1.6M)、1M乙酸和0.11M氯化钙的浓盐溶液，所述溶液4为70％的乙醇溶液，所述溶液5为含有10mM Tris-HCl、1mM EDTA和10-15μg/ml(优选10μg/ml)RNase的RNA清除液，所述絮凝粉为NaOH和SDS按1:6-7(优选1:6)质量比的混合物。

其中，溶液2、溶液3、溶液4和溶液5均用双蒸水配制。所用试剂均为分析纯级别以上。溶液3和溶液5均保存于4℃，其它溶液室温保存。

溶液5作为RNA清除液，先用双蒸水配制Tris-HCl和EDTA的混合液，高压灭菌后，再按比例加入RNase。

本发明提供利用上述试剂盒提取质粒的方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜培养16～24小时的高拷贝质粒大肠杆菌菌液收集入离心管中(10～500ml菌液收集入50ml离心管中，或1～10ml菌液收集入2ml离心管中)，2100g-16000g离心1-10min，将菌体沉淀于管底部；

(2)按每1ml菌液加入10μl溶液1的量，向菌体沉淀中加入溶液1，涡旋，直到菌体悬浮均匀，得到菌悬液；

(3)按每1ml菌液加入20μl溶液2的量，向上述菌悬液中加入溶液2，颠倒离心管5～10次，动作轻柔，室温下放置3～5min，得到裂解液；

(4)按每1ml菌液加入30μl溶液3的量，向上述裂解液中加入溶液3，盖紧瓶盖上下剧烈摇动10-15次(优选10次)，然后3000g-16000g离心2-5min，将上清转入新的离心管内；

(5)按每1ml菌液加入0.04g絮凝粉的量，向上清中加入絮凝粉，盖紧瓶盖上下剧烈震荡2～3min或涡旋2～3min，于-20℃放置5-10min；然后，4℃2100g-16000g离心2-5min，将上清转入新的无内毒素无核酶的离心管内，且后续步骤中所用耗材均为无内毒素无核酶；

(6)向(5)所得上清中加入1/3体积的异丙醇，颠倒混匀，4℃3000g-16000g离心5-30min，迅速倒掉上清，离心管继续离心1min后，小心吸除残留的异丙醇溶液；

(7)向(6)所得沉淀中加入250-800μl溶液5，吹打混匀，转入新的离心管内(按10ml～500ml菌液转入2ml离心管内，或按1ml～10ml菌液转入1.5ml离心管内)，16000g离心1min后将上清转入新的离心管内；

(8)75℃保温10-15min(优选10min)，然后室温静置30min；

(9)冷却至室温后加入1.2～1.5倍体积的异丙醇，震荡混匀，于12000-16000g(优选16000g)离心10min，快速倒掉上清，重新离心1min后吸除多余的异丙醇溶液；

(10)向(9)所得沉淀中加入0.5～1ml溶液4，12000-16000g(优选16000g)离心2min，小心吸除液体保留沉淀，于室温干燥30-35min(优选30min)；

(11)加入适当体积的无酶水回溶质粒沉淀，-20℃保存或直接用于实验。

前述的方法，步骤(1)具体为：当离心管中的菌液为1-2ml，离心条件为：12000-16000g(优选16000g)离心1min。当离心管中的菌液为3-500ml，离心条件为：2100g以上离心10min。