[发明专利]质粒提取试剂盒及提取质粒的方法

权利要求书

1.一种质粒提取试剂盒，其特征在于，包括溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5和絮凝粉；所述溶液1为双蒸水，所述溶液2为0.21M的NaOH溶液，所述溶液3为含有1.6～2.0M乙酸钾、1M乙酸和0.11M氯化钙的浓盐溶液，所述溶液4为70％的乙醇溶液，所述溶液5为含有10mM Tris-HCl、1mM EDTA和10-15μg/ml RNase的RNA清除液，所述絮凝粉为NaOH和SDS按1:6-7质量比的混合物。

2.利用权利要求1所述试剂盒提取质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将新鲜培养16～24小时的高拷贝质粒大肠杆菌菌液收集入离心管中，2100g-16000g离心1-10min，将菌体沉淀于管底部；

(2)按每1ml菌液加入10μl溶液1的量，向菌体沉淀中加入溶液1，涡旋，直到菌体悬浮均匀，得到菌悬液；

(3)按每1ml菌液加入20μl溶液2的量，向上述菌悬液中加入溶液2，颠倒离心管5～10次，动作轻柔，室温下放置3～5min，得到裂解液；

(4)按每1ml菌液加入30μl溶液3的量，向上述裂解液中加入溶液3，盖紧瓶盖上下剧烈摇动10-15次，然后3000g-16000g离心2-5min，将上清转入新的离心管内；

(5)按每1ml菌液加入0.04g絮凝粉的量，向上清中加入絮凝粉，盖紧瓶盖上下剧烈震荡2～3min或涡旋2～3min，于-20℃放置5-10min；然后，4℃2100g-16000g离心2-5min，将上清转入新的无内毒素无核酶的离心管内，且后续步骤中所用耗材均为无内毒素无核酶；

(6)向(5)所得上清中加入1/3体积的异丙醇，颠倒混匀，4℃3000g-16000g离心5-30min，迅速倒掉上清，离心管继续离心1min后，小心吸除残留的异丙醇溶液；

(7)向(6)所得沉淀中加入250-800μl溶液5，吹打混匀，转入新的离心管内，16000g离心1min后将上清转入新的离心管内；

(8)75℃保温10-15min，然后室温静置30min；

(9)冷却至室温后加入1.2～1.5倍体积的异丙醇，震荡混匀，于12000-16000g离心10min，快速倒掉上清，重新离心1min后吸除多余的异丙醇溶液；

(10)向(9)所得沉淀中加入0.5～1ml溶液4，12000-16000g离心2min，小心吸除液体保留沉淀，于室温干燥25-35min；

(11)加入适当体积的无酶水回溶质粒沉淀，-20℃保存或直接用于实验。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：当离心管中的菌液为1-2ml，离心条件为：16000g离心1min；当离心管中的菌液为3-500ml，离心条件为：2100g离心10min。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)具体为：当步骤(1)离心管中的菌液为1-25ml，离心条件为：12000-16000g离心2min；当步骤(1)离心管中的菌液为26-500ml，离心条件为：2100g以上离心5min。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(5)具体为：当步骤(1)离心管中的菌液为1-25ml，具体操作为：向上清中加入絮凝粉后盖紧瓶盖上下剧烈震荡或涡旋，于-20℃放置5min；然后，4℃16000g离心2min；

当步骤(1)离心管中的菌液为26-500ml，具体操作为：向上清中加入絮凝粉后盖紧瓶盖上下剧烈震荡或涡旋，于-20℃放置10min；然后，4℃2100g离心5min。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(6)具体为：当步骤(1)离心管中的菌液为1-25ml，离心条件为：16000g离心5min；当步骤(1)离心管中的菌液为26-500ml，离心条件为：2100g以上离心30min。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(7)具体为：当步骤(1)离心管中的菌液为1-25ml，向(6)所得沉淀中加入250μl溶液5；

当步骤(1)离心管中的菌液为26-500ml，向(6)所得沉淀中加入800μl溶液4。

8.根据权利要求2-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述质粒的大小为1-10kb。