[发明专利]暗色丝孢霉病病原菌RT-PCR检测引物和探针组合及试剂盒

说明书

本发明提供一种暗色丝孢霉病病原菌实时荧光定量PCR检测引物和探针组合及试剂盒。所述引物和探针组合的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1‑12所示。本发明的试剂盒能够快速、特异、灵敏、稳定对暗色丝孢霉病病原菌进行分子诊断。在建立了可靠的暗色丝孢霉病病原菌检测体系的基础上，本发明针对性地设计了竞争性内参，确保阴性结果的真实可信。同时，本发明在DNA提取方案和分子检测方法上均做了一些针对性对性的优化，以确保暗色丝孢霉病中的病原菌准确检出。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体地说，涉及暗色丝孢霉病病原菌实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测引物和探针组合及试剂盒。

背景技术

暗色丝孢霉病(phaeohyphomycosis)，是指由于一大组暗色真菌所致的皮肤、皮下等浅表组织，乃至深部脏器的感染。这些感染的共同特点是寄生组织内形成暗色的菌丝。暗色丝孢霉病，在世界范围内都有散在病例报道，但主要集中于热带地区。暗色丝孢霉病包括浅表型暗色丝孢霉病、暗色真菌性角膜炎、皮肤和皮下组织的暗色丝孢霉病、系统性暗色丝孢霉病。其中，以皮肤和皮下组织的暗色丝孢霉病最为常见，而其最主要的致病菌主要来自于外瓶霉属(Exophiala)和瓶霉属(Phialophora)。其中，又以外瓶霉属病原菌包括皮炎外瓶霉、甄氏外瓶霉、棘状外瓶霉和瓶霉属的疣状瓶霉较常见。

目前，皮肤和皮下组织的暗色丝孢霉病，通常是以镜检、培养、组织病理等方法进行诊断，并结合临床症状进行经验性用药。因此，开发精准的分子诊断技术，用于对暗色丝孢霉病的诊疗，有着非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种暗色丝孢霉病病原菌实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测引物和探针组合及试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种用于非疾病诊断目的检测暗色丝孢霉病病菌的方法。

本发明的再一目的是提供一种改良的DNA提取方法。

为了实现本发明目的，本发明的暗色丝孢霉病病原菌实时荧光定量PCR检测引物和探针组合，该组合包括：

(I)用于检测暗色真菌的通用引物和探针，所述暗色真菌包括瓶霉属、外瓶霉属、枝孢霉属和着色霉属的暗色真菌(SEQ ID NO:1-3)

Panblack-F：5′-CTGATCTGTCCTCCTAATCG-3′

Panblack-R：5′-GCCTGCTTTGAACACTCTAAT-3′

Panblack-P：5′-FAM-ATGCCCTTC[A][C][T]GGGTGT-BHQ1-3′

其中，[A]、[C]、[T]表示锁核酸；

(II)用于检测皮炎外瓶霉的特异性引物和探针(SEQ ID NO:4-6)

Eder-F：5′-GTGTTGGACGGTCTGGTC-3′

Eder-R：5′-ATACGTGCTCAGTGAAGAAG-3′

Eder-P：5′-FAM-AATGACGGCGGCCTGGTTGGAC-BHQ1-3′；

(III)用于检测甄氏外瓶霉的特异性引物和探针(SEQ ID NO:7-9)

Ejea-F：5′-CTTCAAACCGTCCTCTGG-3′

Ejea-R：5′-AACAACGGATCTCTTGGTT-3′

Ejea-P：5′-FAM-GCCCGCGCTCGTCGGTGG-BHQ1-3′；以及

(IV)用于检测疣状瓶霉的特异性引物和探针(SEQ ID NO:10-12)