[发明专利]暗色丝孢霉病病原菌RT-PCR检测引物和探针组合及试剂盒

权利要求书

1.暗色丝孢霉病病原菌实时荧光定量PCR检测引物和探针组合，其特征在于，该组合包括：

(I)用于检测暗色真菌的通用引物和探针，所述暗色真菌为瓶霉属、外瓶霉属、枝孢霉属和着色霉属的暗色真菌：

Panblack-F：5′-CTGATCTGTCCTCCTAATCG-3′，

Panblack-R：5′-GCCTGCTTTGAACACTCTAAT-3′，

Panblack-P：5′-FAM-ATGCCCTTC[A][C][T]GGGTGT-BHQ1-3′；

其中，[A]、[C]、[T]表示锁核酸；

(II)用于检测皮炎外瓶霉的特异性引物和探针：

Eder-F：5′-GTGTTGGACGGTCTGGTC-3′，

Eder-R：5′-ATACGTGCTCAGTGAAGAAG-3′，

Eder-P：5′-FAM-AATGACGGCGGCCTGGTTGGAC-BHQ1-3′；

(III)用于检测甄氏外瓶霉的特异性引物和探针：

Ejea-F：5′-CTTCAAACCGTCCTCTGG-3′，

Ejea-R：5′-AACAACGGATCTCTTGGTT-3′，

Ejea-P：5′-FAM-GCCCGCGCTCGTCGGTGG-BHQ1-3′；以及

(IV)用于检测疣状瓶霉的特异性引物和探针

PV-F：5′-CTTGCTGCATGTTGCTTTGGC-3′，

PV-R：5′-TAGGTTGGCTATCGGCGGAC-3′，

PV-P：5′-FAM-GGACCCGTCTCACGACCGCC-BHQ1-3′。

2.含有权利要求1所述引物和探针组合的用于实时荧光定量PCR检测暗色丝孢霉病病原菌的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括竞争性内参模板Panblack-IAC、Eder-IAC、Ejea-IAC、PV-IAC和内参探针IACP，其序列信息如下：

Panblack-IAC：5′-CTGATCTGTCCTCCTAATCGAGCTGACTTGAACTGACTGGACCTGCCATGATTAGAGTGTTCAAAGCAGGC-3′，

Eder-IAC：5′-GTGTTGGACGGTCTGGTCAGCTGACTTGAACTGACTGGACCTGCCATGCTTCTTCACTGAGCACGTAT-3′，

Ejea-IAC：5′-GCCTTCAAACCGTCCTCTGGAGCTGACTTGAACTGACTGGACCTGCCATGAACCAAGAGATCCGTTGTT-3′，

PV-IAC：5′-CTTGCTGCATGTTGCTTTGGCAGCTGACTTGAACTGACTGGACCTGCCATGGTCCGCCGATAGCCAACCTA-3′，

IACP：5′-TAMRA-ACTTGAACTGACTGGACCTG-BHQ1-3′。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，还包括消化液、蛋白酶K、DNA裂解液、玻璃珠中的至少一种；

其中，所述消化液配方如下：

100mM Tris-HCl pH 8.5

20mM EDTA pH 8.0

0.5％ SDS

所述DNA裂解液配方如下：

所述玻璃珠的直径为710-1180μm的酸洗玻璃珠。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述玻璃珠为直径800μm的酸洗玻璃珠。

6.用于非疾病诊断目的检测暗色丝孢霉病病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样品的DNA；

2)以上述提取的DNA为模板，利用权利要求2-5任一项所述试剂盒，分别进行实时荧光定量PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。