[发明专利]用于检测斯氏弓形菌的荧光PCR引物、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于食品安全领域，具体涉及斯氏弓形菌检测用引物和探针组、试剂盒及检测方法。

背景技术

弓形菌(Arcobacter)是一种新型食源性致病菌，国际食品微生物标准委员会(International Commission on Microbiological Specifications for Foods，ICMSF)2002年将其规为对人类健康有严重危害类微生物。弓形菌中的布氏弓形菌(A.butzleri)、嗜低温弓形菌(A.cryaerophilus)和斯氏弓形菌(A.skirrowii)被认为与人类疾病相关。

弓形菌与弯曲菌亲缘关系近、形态相似，呈弯曲或螺旋形杆状、不产芽胞，但两者生长特性有一定差异，弓形菌较弯曲菌生长温度范围更广、氧气耐受性更强，因而较弯曲菌更易存活。生长温度、氧气耐受性的差异和其它生化特性常用于鉴别弓形菌属和弯曲菌这2个属。自从Ellis等1977年首次建立了弓形菌的分离方法以来，不同学者建立了多种不同的增菌和平板分离模式的传统方法，其中以1999年Johnson和Murano建立的方法被认为是最好的方法。但是，由于弓形菌的生理生化特性表型差异性较大，导致其难以依赖传统的生理生化特性进行弓形菌种间分型鉴定。有学者的人工添加实验表明，添加了斯氏弓形菌的某些样品采用传统检测方法无法分离出此菌。这与斯氏弓形菌比其它弓形菌对抗生素更敏感、其生长繁殖速度也较慢有关，因而比其它弓形菌更难在含抗生素的培养基上生长。弓形菌检测的传统增菌平板分离方法与其它微生物传统检测方法一样，用于弓形菌的检测同样存在步骤复杂、检测周期长等许多的不足，非常有必要建立一种快速、准确的检测斯氏弓形菌的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测斯氏弓形菌的荧光PCR引物、试剂盒及检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

用于检测斯氏弓形菌的荧光PCR引物及探针，其是根据斯氏弓形菌的23S rRNA基因特异性序列所设计的。

所述引物及探针的核苷酸序列如下所示：

上游引物：5’-ATGCTCGTCATCGTAGGGTT-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5’-AGCGGATTTGCCTACTTAACAAC-3’(SEQ ID NO.2)；

探针：HEX-ATCGAGGTCACGGATGGAAGTGT-BHQ1(SEQ ID NO.3)。

一种用于检测斯氏弓形菌的试剂盒，其包括以上所述的荧光PCR引物及探针。

斯氏弓形菌的荧光PCR检测方法，包括如下步骤：

(1)提取样品DNA；

(2)以样品DNA为模板，利用上述的荧光PCR引物、探针进行荧光PCR扩增；

(3)根据扩增曲线来判断样品中是否含有斯氏弓形菌。

荧光PCR扩增体系中含有以下组分：

荧光PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火1min，收集荧光，40个循环。

本发明的有益效果是：

本发明提供的实时荧光PCR反应方法结合上述引物和探针组具有以下特点：特异性强、灵敏度高、检测快速可靠、操作简便的特点。

附图说明

图1为实施例1中进行实时荧光PCR的结果示意图；

图2、图3为实施例1中进行2株斯氏弓形菌的实时荧光PCR扩增曲线的结果示意图；

图4、图5为实施例3中进行灵敏度实验的结果示意图。

具体实施方式

实施例1检测斯氏弓形菌的荧光PCR检测方法的建立

1、引物设计

根据斯氏弓形菌的23S rRNA基因特异性序列设计了一对特异性引物，序列如下所示：

上游引物：5’-ATGCTCGTCATCGTAGGGTT-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5’-AGCGGATTTGCCTACTTAACAAC-3’(SEQ ID NO.2)；

探针：HEX-ATCGAGGTCACGGATGGAAGTGT-BHQ1(SEQ ID NO.3)。

2、荧光PCR检测

配置总体积为25μL的实时荧光PCR的反应体系，具体为：