[发明专利]一种燕麦花叶病毒的RT‑PCR检测方法、引物和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物物种分子诊断领域，具体地说，涉及一种燕麦花叶病毒的RT-PCR检测方法、引物和试剂盒。

背景技术

燕麦花叶病毒(Oat mosaic virus，OMV)为马铃薯Y病毒科(Potyviridae)，大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)，为线状，常弯曲，无包膜，具有明显的形态长度，长约600～750nm，宽12～14nm。OMV主要侵染燕麦属植物，引起秋季播种的燕麦发病，可以引起39～60％的减产。OMV的传播主要依赖禾谷多粘菌以持久性方式传播，长距离扩散则随感病植株的无性繁殖材料传播。目前，OMV主要分布于美国、加拿大、新西兰、英国、法国、爱尔兰等国，在我国尚未见发生，2007年农业部862号公文《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》将其列为重要的对外检疫性有害生物。因此，建立该病毒的快速检疫鉴定技术及相关检测标准具有非常重要的经济价值和社会价值。

半个世纪来，现代病毒学研究水平不断提高，病毒的检测技术也在不断发展和改进。目前病毒的检测方法主要包括枯斑和指示植物检测法，酶标免疫吸附法(ELISA)，电镜负染检测法，免疫电镜检测法，电镜超薄切片法以及PCR检测方法。血清学方法是目前普遍运用的常规检测方法，可操作性强，检测结果相对可靠。但是该方法依赖于高质量的抗血清，成本较高，周期性长，且灵敏度有限，难以检测含量很少的病毒。同时，燕麦花叶病毒所在的大麦黄花叶病毒属各个成员在血清学上密切相关，因而难以采用ELISA方法来准确检测燕麦花叶病毒。

PCR技术也是目前国内外植物病毒检测中应用较成功的方法。专利CN 102102133 A“棉花曲叶病毒检测用引物”公开了棉花曲叶病毒定性PCR检测方法。但是，迄今为止，缺乏一种针对燕麦花叶病毒的特异性强、灵敏度高的RT-PCR检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，针对OMV的外壳蛋白基因(CP gene)设计一对特异性检测燕麦花叶病毒的引物，并优化反应体系和反应程序，建立了RT-PCR快速检测OMV病毒的方法。该方法具有很强的特异性，可以从大麦黄花叶病毒属中特异性检出OMV病毒。该方法灵敏度高、特异性强、快速高效，检测结果准确可靠，非常适合在检验检疫口岸的推广应用。

为此，本发明所采用的技术方案是：

一种用于燕麦花叶病毒的RT-PCR检测的引物，包括上游引物OMV-F2、下游引物OMV-R2，其序列分别如下：

OMV-F2：5′-CCTCGGATGGTGCGTCAATA-3′；(SEQ ID No.1)

OMV-R2：5′-AACCCTGTGGTGGGTTGTTT-3′。(SEQ ID No.2)

一种燕麦花叶病毒的RT-PCR检测方法，包括使用上述引物进行PCR扩增的步骤。

进一步地，该检测方法包括以下步骤：

S1、取待测样品提取植物组织总RNA；

S2、以总RNA为模板，引入下游引物OMV-R2进行反转录模板cDNA的合成；

S3、将上游引物OMV-F2、下游引物OMV-R2置于PCR仪中进行PCR扩增反应；

S4、对扩增产物进行电泳分离，鉴定样品中是否含有燕麦花叶病毒。

进一步地，所述步骤S2中进行反转录模板cDNA的合成时，其反应体系为：

反应条件为：37℃保温60min，70℃15min灭活反转录酶。

进一步地，所述dNTP的浓度为10mmol/L，所述下游引物OMV-R2的浓度为10μmol/L。

进一步地，所述步骤S3中PCR反应体系为：

反应条件为：95℃5min；95℃1min，60℃50s，72℃60s，35个循环；72℃10min。

进一步地，所述上游引物OMV-F2和下游引物OMV-R2的浓度均为10μmol/L。

一种燕麦花叶病毒的RT-PCR检测试剂盒，包含以上所述的引物。

本发明的有益效果是：本发明针对检疫性有害生物燕麦花叶病毒，设计了特异性引物，建立了RT-PCR快速检测OMV的方法，具有检测快速简单、特异性好、灵敏度高、稳定性强等优点，检测时间也缩减到2小时之内，极大的提高了效率，适用于我国各大检验检疫机构针对检疫性有害生物燕麦花叶病毒的鉴定。

附图说明

图1是实施例RT-PCR检测OMV的特异性结果；