[发明专利]一种使用多内参基因组合研究牦牛胚胎基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用多内参基因组合进行实时荧光定量PCR研究牦牛胚胎基因的方法，尤其涉及研究牦牛胚胎器官发育和低氧适应相关功能基因的方法。

背景技术

牦牛(Bos grunnien)是能在高海拔地区生存并延续至今的稀有牛种，能在高寒、缺氧、牧草生长期短等极为恶劣的环境下生活自如、繁衍后代，为牧民提供奶、肉、毛、役、燃料等生产和生活资料，具有“高原之舟”的美称。牦牛生活在以我国青藏高原为中心，围绕喜马拉雅山、帕米尔、昆仑山、天山、阿尔泰山等几大山脉向外延伸的地区。中国的牦牛分布在青海省、西藏藏族自治区、四川省、甘肃省、新疆维吾尔族自治区和云南省，中国的牦牛数量占世界牦牛总数的92%。经过长期的自然选择和进化，牦牛的各器官在胚胎发育时期就已经从生化和形态学上获得了稳定的适应高原低氧的遗传学特征和独特机制，因此研究胚胎期牦牛器官中低氧适应相关的功能基因需进一步挖掘和鉴定。

目前常用于检测基因表达水平的方法有DNA微阵列(DNA microarray)、Northern印迹(northern blot)、原位杂交 (in situ hybridization, ISH)和实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain, qRTPCR)等。其中，qRT-PCR在定量分析mRNA表达中具有灵敏性高、特异性强、快速准确、操作简单、成本较低等特点，被广泛应用于分子医学、生物科学、微生物学以及诊断学等领域。然而qRT-PCR对RNA的质量和完整性以及模板cDNA的质量和数量、引物的特异性、扩增效率、内参基因的选择等要求严格(Bustin, 2000; VanGuilder et al., 2008)。选用一种合适的内参基因对目的基因的表达量进行校正可以提高该方法的灵敏度和重复性。理想的内参基因应该在任何实验环境和条件下均能稳定表达，然而许多研究表明任何一种内参基因在所有的试验条件下的表达都不稳定，在不同组织、不同发育阶段或不同环境胁迫等条件下，内参基因的表达量存在差异。因此，在进行基因表达分析之前应确定稳定表达的管家内参基因对获得准确的qRT-PCR实验结果是非常重要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、操作简便的使用多内参基因组合研究牦牛胚胎基因的方法。本申请人选择10个在家畜不同器官组织以及器官在不同发育时期稳定表达的内参基因（ACTB、B2M、HPRT1、GAPDH、18SrRNA、28SrRNA、PPIA、UBE2D2、SDHA和TBP）（Bionaz et al., 2007; Karen et al., 2005），以筛选一个通用的牦牛内参基因检测引物，来满足牦牛低氧适应相关的功能基因功能研究的需要。

本发明提供一种使用多内参基因组合研究牦牛胚胎基因的方法，包括以下步骤：

（1）提取牦牛胚胎组织的总RNA，反转录为cDNA；

（2）使用多个内参基因，分别设计特异性引物进行实时荧光定量PCR反应，得到Ct值；

（3）根据步骤（2）获得的Ct值，用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件筛选出最稳定的内参基因组合；

（4）将步骤（3）获得的内参基因组合和目的基因一起进行qRT-PCR反应，计算目的基因在各组织中的相对表达量。

作为优选，步骤（2）中所述多个内参基因为：ACTB、B2M、HPRT1、GAPDH、18SrRNA、28SrRNA、PPIA、UBE2D2、SDHA和TBP。

作为优选，步骤（2）中所述实时荧光定量PCR反应体系为：

SYBR Premix Ex TaqTM10µl

上游引物S（20 mmol·L^-1）0.8µl

下游引物A（20 mmol·L^-1)0.8µl

ddH₂O7.4µl

cDNA 模板1µl。

作为优选，步骤（2）中所述实时荧光定量PCR反应程序为：95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s，55℃ 30 s，40个循环后进入溶解曲线程序。

作为优选，步骤（3）中筛选得到的最稳定的内参基因组合为ACTB和TBP。

本发明还提供用于研究牦牛胚胎基因的多内参基因组合，所述多内参基因组合为ACTB和TBP。