[发明专利]一种促进角膜内皮细胞功能和特性的方法

说明书

本发明公开了一种促进角膜内皮细胞功能和特性的方法，包括以下步骤：分离和培养人眼眶脂肪干细胞并提取条件培养基；分离和培养原代人角膜内皮细胞；在培养人角膜内皮细胞的基础培养基中加入所述条件培养基对人角膜内皮细胞进行培养增殖。本发明利用从人眼眶脂肪干细胞提取的条件培养基培养得到的人角膜内皮细胞的贴壁及增殖能力强。经过试验得到，该方法下体外培养的人角膜内皮细胞可以传10代以上，扩增倍数更多，并能保持人角膜内皮细胞的形态及功能。动物实验证实该方法下体外培养的人角膜内皮细胞具有优异的细胞修复功能。

技术领域

本发明属于组织工程及眼科修复技术领域，具体涉及一种促进角膜内皮细胞功能和特性的方法。

背景技术

角膜分为5层，由前向后依次为：上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层。其中，位于最内层的内皮细胞层对于维持角膜透明及其正常的生理功能具有十分重要的意义。内皮细胞为一单层细胞，细胞高约50um，宽约20um。人角膜内皮细胞(humancorneal endothelial cells，Hcecs)通过泵功能和屏障功能，调控角膜的透明性。随着年龄增加，角膜内皮细胞的密度逐渐降低，当细胞密度小于500-800个/mm²时则会引起角膜内皮失代偿，导致角膜持续水肿失去透明性。由于成人角膜内皮细胞缺乏增殖能力，角膜内皮细胞受损后只能依赖损伤区周边细胞的扩展和移行进行修复。

目前，人角膜内皮细胞是治疗角膜内皮功能失代偿最理想的种子细胞。而角膜供体匮乏是全球性问题，人们通过体外培养角膜内皮细胞使其增殖以进行角膜内皮细胞移植和组织工程学等研究。常用的培养方法是从供体上撕除后弹力层和角膜内皮层，用酶消化法提取角膜内皮细胞，培养基为基础培养基加各种生长因子。

但体外培养角膜内皮细胞存在以下缺点：经多次传代后不能维持其正常的细胞形态和功能，尚无法应用于临床治疗及相关研究。因此，目前亟需一种合适的培养方法来解决人角膜内皮细胞无法多次传代并保持细胞形态和功能的问题。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种可使角膜内皮细胞多次传代后仍保持正常形态，并促进其功能和特性的方法。本发明首先分离和培养人眼眶脂肪干细胞(orbital adipose-derived stem cell，O-ASC)并提取条件培养基。然后提取原代人角膜内皮细胞，在人角膜内皮细胞基础培养基内加入人眼眶脂肪干细胞条件培养基进行培养。结果显示该方法下体外培养的人角膜内皮细胞可以传10代以上，在保持正常形态的同时还能促进细胞的增殖修复等能力，相比于现有技术中的培养方法，取得了意想不到的技术效果。

本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种促进角膜内皮细胞功能和特性的方法，包括以下步骤：

分离和培养人眼眶脂肪干细胞(O-ASC)并提取条件培养基；

分离和培养原代人角膜内皮细胞；

在培养人角膜内皮细胞的培养基中加入所述条件培养基对人角膜内皮细胞进行培养增殖。

本发明所述的促进角膜内皮细胞功能和特性是指促进多次传代后角膜内皮细胞的增殖分化能力及修复能力，同时保持其多边形态。

人角膜内皮细胞由来源于外胚层的神经嵴(干)细胞发育而来，而人眼眶脂肪干细胞同样为神经嵴来源，并且具有较强的增殖能力和多系分化潜能。我们认为O-ASC能够通过旁分泌等机制即其培养液中的细胞因子对角膜内皮细胞的增殖及功能起到促进作用，因此本发明选用人眼眶脂肪干细胞作为条件培养基的细胞来源。实验结果证实该条件培养基能够有效促进人角膜内皮细胞的增殖能力及修复功能。

所述分离和培养人眼眶脂肪干细胞的方法包括以下步骤：