[发明专利]一种促进角膜内皮细胞功能和特性的方法

权利要求书

1.一种促进角膜内皮细胞功能和特性的方法，其特征是，包括以下步骤：

分离和培养人眼眶脂肪干细胞并提取条件培养基；

分离和培养原代人角膜内皮细胞；

在培养人角膜内皮细胞的培养基中加入所述条件培养基对人角膜内皮细胞进行培养增殖；

其中，分离和培养人眼眶脂肪干细胞的方法包括以下步骤：

无菌条件收集人眼眶脂肪组织，PBS冲洗数遍，用乙醇浸泡30s，再采用PBS冲洗数遍，剔除肉眼可见的血管及结缔组织，剪碎至颗粒状，加入胶原酶消化液，置于恒温摇床中振荡消化；然后加入同体积含有FBS的低糖DMEM培养基中和，离心；弃去上层脂肪及液体，无菌PBS重悬，离心，弃去上层液体，加入DMEM培养基，滤网过滤，混匀后加入无菌培养皿，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养；48-72小时后首次换液，之后每2-3天换液1次，待细胞融合至80-90％时进行传代培养。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述提取条件培养基的方法包括以下步骤：

使用2-10代的O-ASC，待O-ASC生长至50-80％满时，弃去培养基，无菌PBS漂洗一次，加入DMEM培养基继续培养12-24小时后收集细胞培养上清液，收集好的上清液用滤器过滤后，即是人眼眶脂肪干细胞条件培养基，-80℃保存备用。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是：分离和培养原代人角膜内皮细胞的方法包括以下步骤：

显微镜下用镊子将角膜内皮细胞层和后弹力层一起撕下，用基础培养基、37℃培养箱中孵育过夜使其稳定；然后离心，弃上清，加入胶原酶消化；吹打多次从后弹力层上分离角膜内皮细胞，离心，弃上清，得到原代人角膜内皮细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是：人角膜内皮细胞进行培养增殖方法包括以下步骤：用含有所述条件培养基的基础培养基重悬得到的原代人角膜内皮细胞，将细胞悬液接种到培养板中的一孔中，37℃、5％CO₂的状态下培养；48h后首次换液，之后隔天换液，当细胞达到融合状态后1:2传代。

5.采用权利要求1～4中任一项所述的方法制备得到的人角膜内皮细胞在制备治疗角膜内皮功能失代偿药物中的应用。

6.一种角膜内皮细胞培养用培养基，其特征是：包括以下人角膜内皮细胞基础培养基和质量为其10～20％的权利要求2所述的条件培养基，其中，所述人角膜内皮细胞基础培养基，包含Opti-MEM-I，胎牛血清(FBS)，表皮细胞生长因子(EGF)，抗坏血酸，CaCl₂，硫酸软骨素和青霉素-链霉素混合液。

7.如权利要求6所述的培养基，其特征是：在Opti-MEM-I中，FBS的体积分数为8％，EGF浓度为5ng/mL，抗坏血酸的浓度为20ug/mL，CaCl₂的浓度为200mg/L，硫酸软骨素的质量体积分数为0.08％(w/v)，青霉素-链霉素混合液的体积分数为1～1.25％。