[发明专利]一种检测牛、羊、猪源性成分的三重实时荧光PCR方法

说明书

检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR方法，具有样品DNA、一对通用引物和三条探针、荧光PCR预混液、阳性对照等4个要素；根据牛、绵羊和山羊、猪的甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶基因设计引物和探针，对目标序列进行扩增并激发和淬灭荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方和扩增条件制成试剂盒；具体做法包括：建立检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR引物体系；建立检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR试剂盒；确定检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR鉴定方法。本发明具有标准误差小、检测时间短、可同时检测多个目标基因、节约试剂成本的优点；适用于动物产品的真假鉴别。

技术领域

本发明涉及包括基因的鉴定方法，特别涉及动物产品的源性检测及真假鉴别的方法。

背景技术

当前，动物产品的绝大部分有添加香精香料、添加调味剂，且经过加工，消费者仅通过观察和感官品评，难辨真伪。

在利用分子生物学技术鉴定动物产品真伪及掺假检测的方法研究中，通过PCR技术扩增并检测目标动物源性基因，是目前主流的科学依据和技术手段，近年来得到广泛的应用。常规PCR技术在该领域具有如下几个特点：①绝大多数动物产品可以提取到DNA；②设计合理的引物对可特异性地识别目的动物源性基因；③核心设备为PCR仪。

常规PCR为第一代PCR技术，而第二代PCR技术为实时定量荧光PCR(以下简称荧光PCR)。荧光PCR扩增时，在加入一对引 物的同时加入一个特异性的荧光探针，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。相对常规PCR具有如下特点：①特异性探针的加入，进一步提升了整个PCR扩增的特异性；②PCR扩增过程即检测过程，反应结束即可获得检测结果，整体检测时间更短；③核心设备为实时定量荧光PCR仪。

多重实时定量荧光PCR(以下简称多重荧光PCR)属于实时定量荧光PCR的一种，首先针对多个目的基因，逐项设计特异性的引物对和探针序列；接着在多个探针上分别标记不同波长的荧光基团及淬灭基团，从而可以对一个PCR反应管内的DNA模板同时进行多个目的基因的荧光PCR扩增并发出不同荧光信号，被多通道实时定量荧光PCR仪中相应的多波长检测器捕获，达到同时检测多个目的基因的要求。相对普通的荧光PCR有如下优点：①每增加一套引物对和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂的成本降低一倍；②核心设备为多通道实时定量荧光PCR仪。

中国专利数据库中涉及动物源性成分鉴定的PCR技术的专利申请件已有百余件，但多为普通PCR方法。仅有几种为多重荧光PCR方法，如20151012723.2《同时检测肉及肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR方法及引物探针以及试剂盒》、201610272771.5《一种阿胶中驴、马、牛和猪源性巢式荧光PCR检测引物、探针、试剂盒、检测方法及应用》、201510527762.1《鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及多重 荧光PCR检测方法》等，本申请件与这些申请件在检测领域和对象上各不相同，核心的引物、探针序列及荧光标记也完全不同。

发明内容

本发明旨在提供检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR方法，以解决动物制品的真假鉴别问题。

发明人提供的检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR方法，具有三重荧光PCR技术的4个要素，即：样品DNA、一对通用引物和三条探针、荧光PCR预混液、阳性对照；发明特点是根据牛(Bos taurus)、绵羊(Ovis aries)和山羊(Capra aegagrus)、猪(Sus scrofa)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(英文名Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，以下简称GAPDH)基因设计引物和探针，仅能对目标序列进行扩增并激发和淬灭荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方和扩增条件制成试剂盒；具体的做法包括：

第一步，建立检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR引物和探针体系；