[发明专利]一种检测牛、羊、猪源性成分的三重实时荧光PCR方法

权利要求书

1.检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR方法，具有三重荧光PCR技术的4个要素，即：样品DNA、一对通用引物和三条探针、荧光PCR预混液、阳性对照；其特征在于：根据牛、绵羊和山羊、猪的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因设计引物和探针，对目标序列进行扩增并激发和淬灭荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方制成试剂盒；具体的做法包括：

第一步，建立检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR引物体系；

第二步，建立检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR试剂盒；

第三步，确定检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR鉴定方法，即以待测样品总DNA为模板，利用所述的三重荧光PCR引物体系，在可同时检测FAM、HEX、TARMA激发荧光信号和MGB淬灭荧光信号的三通道及以上的荧光PCR仪上进行扩增和检测；

所述检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR引物体系：序列1为牛、羊、猪的通用上游引物，序列2为牛、羊、猪的通用下游引物，序列3为牛源特异性探针，序列4为羊源特异性探针，序列5为猪源特异性探针；序列3、4、5在5’端分别用FAM、HEX、TARMA荧光激发基团修饰，3’端均为MGB荧光淬灭基团修饰。

2.按照权利要求1所述的三重荧光PCR方法，其特征在于所述检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR试剂盒成分如下所示：

①引物：包括序列1、2所示引物，浓度均为20 μmol/L，使用1.5 mL无色透明离心管封装；

②探针：包括序列3、4、5所示探针，浓度均为10 μmol/L，使用1.5 mL棕色不透明离心管封装；

③荧光PCR试剂：经验证可适用于所述的三重荧光PCR引物体系的外购的试剂套装，包括荧光PCR预混液、ROX染料、三蒸水；

④阳性对照：包括含有序列1和序列2所示引物扩增目的片段的牛、羊、猪源性DNA，浓度均为10⁵拷贝/μL，使用1.5 mL无色透明离心管封装。

3.按照权利要求1所述的三重荧光PCR方法，其特征在于所述检测牛、羊、猪源性成分的三重荧光PCR鉴定方法中，所述待测样品总DNA来源：对于待测样品，通过试剂法、柱膜法、磁珠法或外购试剂盒，提取样品DNA；所述多重荧光PCR仪上进行扩增和检测的方法是选择25μL或50 μL体系进行反应液配制，再设置反应条件，按判定条件进行结果判定；所述判定条件包括：

① 质控标准：阳性对照的FAM、HEX、TARMA荧光信号有荧光对数增长，且Ct值≤ 28；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，Ct值≥ 40.0；

② 阳性样品：当①成立时， FAM或/和HEX或/和TARMA有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，表明该样品检出牛或/和羊或/和猪源性成分；

③ 阴性样品：当①成立时，FAM或/和HEX或/和TARMA无荧光对数增长，Ct值≥ 40.0，表明该样品未检出牛或/和羊或/和猪源性成分；

④ 疑似样品：当①成立时，FAM或/和HEX或/和TARMA有荧光对数增长，且30.0Ct值40.0，重复检测一次；复检结果Ct值≥ 40.0，表明该样品未检出牛或/和羊或/和猪源性成分；复检结果Ct值 40.0，表明该样品检出牛或/和羊或/和猪源性成分。

4.按照权利要求3所述的三重荧光PCR方法，其特征在于所述反应液配制如下表所示：

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5.按照权利要求3所述的三重荧光PCR方法，其特征在于所述反应条件如下表所示：

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