[发明专利]存在于人体外周静脉血中的脑源性微粒及其分离提纯鉴定方法和应用

说明书

本发明公开了一种存在于人体外周静脉血中的脑源性微粒及其分离提纯鉴定方法和应用。本发明脑源性微粒的磷脂双分子膜上富含磷脂酰丝氨酸和组织因子并携带神经细胞特异性标记物。本发明脑源性微粒具有制备治疗创伤性颅脑损伤引发的凝血功能障碍药物的用途。本发明脑源性微粒的分离提纯鉴定方法为：采集脑创伤病人/健康人血液样本；分离提纯人源性BDMPs；应用流式细胞技术鉴定人源性BDMPs。本发明建立了一种灵敏、精确、定量的人源性BDMPs分离提纯鉴定方法，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及利用特殊方法来研究或分析材料领域，更具体地是一种存在于人体外周静脉血中的脑源性微粒及其分离提纯鉴定方法和应用。

背景技术

微粒（Microparticles，MPs）是一类在某些生理或病理状况下，由正常细胞出芽脱落的富含磷脂的颗粒，具有一定的促凝活性。目前在人体外周静脉血中已经发现了一些血细胞及血管内皮细胞来源的微粒，如：血小板源微粒（Platelet derived MPs，PMPs）、内皮细胞源微粒（Endothelial MPs,EMPs）等。研究结果显示：MPs（如PMPs）具有较强的促凝活性与免疫炎症功能，在血栓性相关疾病等领域中具有很大的研究价值。

创伤性颅脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是我们前期研究工作的重点，颅脑受到创伤后所引发的一系列病理反应直接影响患者的生命及预后，而且病程发展很快。研究TBI的多种病理反应及时阻断病程的发展对疾病的预后有重大意义。

由于脑源性微粒（鼠源性）（Brain-derived microparticles，BDMPs）的概念与特性是我们团队首次在国际上报道，属于最新的研究领域。另外，BDMPs的结构非常微小（直径0.1～1.0μm），使得分离提纯鉴定工作十分困难；并且由于人体十分复杂而又极其精密，使得人体来源的BDMPs的分离提纯鉴定与鼠来源的有很大区别，因此理论和前期工作的实践都表明不能套用照搬鼠源性的实验方案。所以急需一套人源性BDMPs的分离提纯鉴定实验方案以及应用此套方案来探究人源性BDMPs的临床特性。因此很有必要建立一种灵敏、精确、定量的人源性BDMP s检测方法。

发明内容

本发明为了解决鼠源性脑源性微粒的提取方法不能应用于人源性脑源性微粒的提取的问题，所提出一种存在于人体外周静脉血中的脑源性微粒及其分离提纯鉴定方法和应用。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种存在于人体外周静脉血中的脑源性微粒，所述脑源性微粒的磷脂双分子膜上富含磷脂酰丝氨酸和组织因子并携带神经细胞特异性标记物。

一种上述存在于人体外周静脉血中的脑源性微粒在制备治疗创伤性颅脑损伤引发的凝血功能障碍药物中的应用。

一种上述存在于人体外周静脉血中的脑源性微粒的分离提纯鉴定方法，包括以下步骤：

a.采集脑创伤病人/健康人血液样本：

采集脑创伤病人/健康人外周静脉血放入枸橼酸钠抗凝管中，在常温下进行120g-150g离心20 min-30min；

b.分离提纯人源性BDMPs：

Ⅰ.取上层血浆，在常温下进行1500 g-2000g离心20 min-30min；

Ⅱ.取上层血浆，常温下13000 g-15000g离心2 min-5min；

Ⅲ.取上层血浆，4℃下100000 g -120000 g离心60min-70min，留取沉淀，即为BDMPs，用PBS重悬后分别得到病人/健康人的富含BDMPs的悬液，用于后续流式检测；

c.体外培养神经细胞制备BDMPs作为流式细胞技术检测的阳性对照：