[发明专利]存在于人体外周静脉血中的脑源性微粒及其分离提纯鉴定方法和应用

权利要求书

1.一种分离自人体外周静脉血中的脑源性微粒，其特征在于：所述脑源性微粒的磷脂双分子膜上富含磷脂酰丝氨酸和组织因子并携带神经细胞特异性标记物。

2.一种权利要求1所述的分离自人体外周静脉血中的脑源性微粒在制备治疗创伤性颅脑损伤引发的凝血功能障碍药物中的应用。

3.一种权利要求1所述的分离自人体外周静脉血中的脑源性微粒的分离提纯鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

a.采集脑创伤病人和健康人血液样本：

采集脑创伤病人和健康人外周静脉血放入枸橼酸钠抗凝管中，在常温下进行120 g-150g离心20 min-30min；

b.分离提纯人源性脑源性微粒：

Ⅰ.取上层血浆，在常温下进行1500g-2000g离心20 min-30min；

Ⅱ.取上层血浆，常温下13000 g-15000g离心2 min-5min；

Ⅲ.取上层血浆，4℃下100000 g -120000 g离心60min-70min，留取沉淀，即为脑源性微粒，用PBS重悬后分别得到脑创伤病人和健康人的富含脑源性微粒的悬液，用于后续流式检测；

c.体外培养神经细胞制备脑源性微粒作为流式细胞技术检测的阳性对照：

Ⅰ.在神经元细胞和成长到对数生长期的胶质细胞中，加入钙离子超载剂，37℃孵育10-30 min；

Ⅱ.收集细胞上清液，在常温下1500 g-2000g离心20 min-30min；

Ⅲ.取上清，在常温下13000 g-15000g离心2 min-5min；

Ⅳ.取上清，4℃下100000 g -120000 g离心60min-70min，留取沉淀，即为脑源性微粒，用PBS重悬后用于作为流式检测人血脑源性微粒检测的阳性对照；

d. 流式细胞技术鉴定人源性脑源性微粒：

Ⅰ.取9支无菌流式管，分别编号1~9，1号管为无抗体或染料染色的阴性对照管，2，3，4号管分别为PE Mouse anti-GFAP、MitoTracker® Green FM、APC-Annexin V抗体或染料染色的单染管，5、6号管分别为脑创伤病人、健康人，7号管为体外制备脑源性微粒的上述3种抗体或染料染色的三染管；8号管为APC-Annexin V抗体的阴性对照管；9号管为PE Mouseanti-GFAP抗体的阴性对照管；

分别取健康人的富含脑源性微粒的悬液至1，6号管中，分别取脑创伤病人的富含脑源性微粒的悬液至2，3，4，5，8，9号管中，取体外制备脑源性微粒的悬液至7号管中；

Ⅱ.向2，5，6，7号管中加入PE Mouse anti-GFAP抗体，低速震荡，充分混合，室温避光孵育10min-30 min；向9号管中加入同型对照PE Mouse IgG1抗体，低速震荡，充分混合，室温避光孵育10min-30 min；

Ⅲ.用DMSO将免疫荧光染料MitoTracker® Green FM稀释；向3，5，6，7号管中加入免疫荧光染料MitoTracker® Green FM，低速震荡，充分混合，室温避光孵育10min-30 min；

Ⅳ.分别向4，5，6，7号管中加入抗体APC-Annexin V，同时加入4X Annexin V结合试剂，混合后室温避光孵育10min-30 min；向8号管中同时加入抗体APC-Annexin V、EDTA和4XAnnexin V结合试剂，混合后室温避光孵育10min-30 min；

Ⅴ.分别向1，2，3号管中加入4X Annexin V结合试剂，最后分别向1~8号管中加入2XAnnexin V结合试剂将液体体积补足，混匀后进行流式细胞仪检测。